我们提出了一种使用图像捕获和蛋白质组学培养高可重复球体及其表型表征的方案。
我们提出了一种方案,描述了使用独立的恒斜培养箱进行生长、处理和监测 3D 细胞培养物的特性和优势。恒斜器模拟了一种环境,在这种环境中,细胞可以组装成具有低剪切力和活性营养扩散的高度可重复的球状体。我们证明,癌症和非癌症肝细胞(HepG2/C3A 和 THLE-3 细胞系)都需要 3 周的生长才能达到与肝细胞相当的功能。该协议强调了使用带有摄像头监测细胞生长的3D细胞培养箱的便利性,因为可以拍摄快照以在治疗时计数和测量球状体。我们描述了 THLE-3 和 HepG2/C3A 细胞系的比较,展示了非癌细胞系如何生长以及永生化癌细胞。我们演示并说明了如何从几个球状体中进行蛋白质组学实验,这些球状体可以在不干扰细胞信号传导的情况下收集,即不需要胰蛋白酶消化。我们表明,蛋白质组学分析可用于监测呼吸链代谢的典型肝脏表型和参与金属解毒的蛋白质的产生,并描述了一种半自动系统来计数和测量球状体的面积。总而言之,该协议提供了一个工具箱,其中包括通过图像捕获进行的表型表征和用于在 3D 细胞培养模型上进行实验的蛋白质组学管道。
体外细胞培养已被证明是建立生物学基础知识的必要和无价之宝。生物学和癌症的大部分科学知识都来自2D培养系统,即在单层中生长的细胞。尽管 2D 培养一直是主要的细胞培养系统,但它有许多缺点,可能会扼杀进一步的生物学进展。例如,2D 培养物缺乏对细胞信号转导和增殖很重要的细胞间相互作用1。迄今为止,3D 培养系统已被证明可以更好地模拟分化、药物反应、肿瘤侵袭和生物学 2,3,4,5。由于人口老龄化和癌症死亡率的增加,恶性癌症的 3D 建模尤为重要。肝细胞癌 (HCC) 是全球癌症相关死亡的主要原因之一,并且通常预后不佳6.已知肝细胞癌治愈率低、药物反应差、复发率高 6,7,8。已经开发了几种正常肝脏和肝细胞癌的 3D 模型,模拟体内正常和恶性肝组织的生理学 9,10。
目前的一些 3D 系统包括液体覆盖层、生物反应器、水凝胶、支架和 3D 打印结构。在生物反应器中产生的球状体特别具有独特的优势,因为它们模拟营养暴露、气体交换和细胞增殖/静止的肿瘤分布11。生物反应器因其易用性、大可扩展性、营养扩散性和可及性而特别适用于癌症模型11。此外,生物反应器可以进行高通量实验,提高可重复性,并减少人为错误。本研究中使用的生物反应器是独一无二的,因为它模拟了一个降低重力的系统,该系统最大限度地减少了典型生物反应器中施加的破坏性剪切力,从而实现了更好的重现性12。全向重力和剪切力的减少使细胞以更生理的方式发育。作为证据,在这种方法下生长的HepG2 / C3A细胞发育出球形细胞器,可产生体内水平的ATP,腺苷酸激酶,尿素和胆固醇13,14。此外,与 2D 培养相比,该 3D 系统中的药物治疗更先进、自动化。在 2D 培养中,由于需要胰蛋白酶消化和维持细胞健康,药物治疗通常必须具有较短的疗程。然而,在我们的案例中,我们可以对球状体进行长期药物治疗,而无需破坏细胞的结构和生理学。因此,从2D培养到3D培养的转变对于更好地模拟体内生物现象和进一步的科学发展是必要的。
本文介绍了一种生长高可重复球体的方法(图 1 和图 2),并展示了一种表型表征 3D 结构的半自动化系统(图 3)。在图像层面,我们提供了有关计数和测量球体面积的信息(图3)。通过使用质谱方法,我们展示了蛋白质组学如何用于评估特定的生物学功能(图4)。通过收集和分析这些数据,我们希望提高对3D细胞培养系统背后的生物学的理解。
了解三维(3D)细胞结构背后的生物学特性对于更全面地了解其功能极为重要。人们越来越关注使用3D模型来研究复杂的生物学和进行毒性筛选。在3D中培养细胞时,需要考虑许多因素,包括模型系统的表型评估。表型被定义为特定生物体的一组可观察到的特征,例如形态、行为、生理和生化特性20。
在该协议中,我们演示了如何从几个球状体进行蛋白质组学实验,并可用于监测典型的肝脏表型。质谱法已成为一种广泛应用的 3D 细胞表征方法,可以研究各种生物学问题 12、16、21、22。对于全面的蛋白质组分析,建议使用至少 20 μg 蛋白质起始材料,从中将 1 μg 注入质谱仪。值得一提的是,添加较少的样品可能会导致灵敏度下降,而添加更多样品会逐渐降低色谱质量并最终导致色谱柱堵塞。在这项研究中,我们发现 HepG2/C3A 和 THLE-3 球状体富含来自糖酵解和 TCA 循环的重要蛋白质,这些蛋白质是特定的肝脏通路,对维持血糖水平和能量产生至关重要23,24。实际上,质谱分析不仅可以提供蛋白质水平的信息,还可以研究蛋白质翻译后修饰,如我们小组16 之前所示。
3D 表型研究中要考虑的另一个方面是球状体的数量和大小。除了使实验更具可重复性外,计算球状体的数量并确定其大小对于确定何时将培养物分成多个生物反应器至关重要,因为容器内 3D 结构的数量会影响球状体的大小和代谢活性水平。然而,需要强调的是,球状体的数量和大小取决于细胞系、起始细胞数、分裂过程和收集时间。HepG2/C3A 球状体培养的详细信息,例如每个球状体的细胞数、蛋白质含量和大小随年龄的变化,由 Fey、Korzeniowska 和 Wrzesinski25 提供。为了使用此处描述的半自动方法进行准确和成功的分析,最关键的步骤是获得良好的球状体图像。为简单起见,可以用手机或平板电脑拍摄照片,但其分辨率应尽可能高。由于图像可以快速获取,因此可以进行大规模筛选实验,以可视化特定的表型特征或研究对药物治疗的反应。因此,由于基于细胞的检测数量不断增加,在过去 10 年中已经开发了许多用于图像分析的开源软件26。在该协议中,我们描述了一个使用FIJI18 软件来计数和测量球体大小的半自动系统。我们提供了脚本(简单的编程命令)来定义一系列可应用于图像集合的算法操作,使分析成为一个简单快捷的过程。但是,根据球体的特性,应采用手动测量。例如,如果球体太透明,斐济文字将不精确。顺便说一句,这种方法起作用的最重要标准之一是球体的致密性。这一特性将有助于增强球体和背景之间的颜色对比度,这对于方法的准确性是必要的。
总之,除了提出一种生长高可重复球体的方法外,还描述了一种通过图像捕获和蛋白质组学进行表型表征的半自动化系统。我们预计,通过全自动图像分析软件和下一代质谱仪,这个用于分析3D细胞的工具箱将变得更加强大。
The authors have nothing to disclose.
Sidoli实验室非常感谢白血病研究基金会(Hollis Brownstein New Investigator Research Grant)、AFAR(Sagol Network GerOmics 奖)、Deerfield(Xseed 奖)、Relay Therapeutics、默克公司和 NIH 主任办公室 (1S10OD030286-01)。
1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
10 mL syringe | Fisher Scientific | 1481754 | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
1000 µL wide bore pipet tips | Fisher Scientific | 14222703 | |
200 µL wide bore pipet tips | Fisher Scientific | 14222730 | |
96-well Orochem filter plate | Orochem | OF1100 | |
96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C | |
96-well vacuum manifold | Millipore | MAVM0960R | |
Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-25G | |
Bronchial Epithelial Cell Growth Medium (BEGM) | Lonza | CC-3170 | |
Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
ClinoReactor | CelVivo | N/A | Bioreactor for 3D cell culture |
ClinoStar incubator | CelVivo | N/A | CO2 incubator for 3D cell culture |
DTT | Sigma | D0632-5G | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Fisher Scientific | MT17205CV | |
Elplasia 24-well round bottom ultra-low attachment plate containing microwells | Corning | 4441 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35010CV | |
Formic acid | Thermo | 28905 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | MT21022CV | |
hEGF | Corning | 354052 | |
HERAcell vios 160i | Thermo | 51033557 | CO2 incubator for 2D cell culture |
HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452-1 | |
HPLC grade water | Fisher Scientific | W5-4 | |
Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
L-glutamine | Fisher Scientific | MT25015CI | |
Non-essential amino acids | Fisher Scientific | MT25025CI | |
Oasis HLB Resin 30 µm | Waters | 186007549 | |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
PAULA microscope | Leica | ||
Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | MT3002CI | |
PerkinElmer Victor X2 multilabel microplate reader | PerkinElmer | ||
pH paper | Hydrion | 93 | |
Phosphoetanolamine | Sigma | P0503 | |
Phosphoric acid | Fisher Scientific | A260-500 | |
Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Milipore Sigma) | |
Refrigerated centrifuge | Thermo | 75-217-420 | |
Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 μM bead size |
SDS | Bio-Rad | 1610301 | |
Sequencing grade modified trypsin | Promega | V511A | |
SpeedVac vacuum concentrator (96-well plates) | Thermo | 15308325 | Savant SPD1010 |
Sterile hood | Thermo | 1375 | |
Sterile serological pipettes | Fisher Scientific | 1367549 | |
S-trap | Protifi | C02-micro-80 | |
Syringe needle (18 G) | Fisher Scientific | 14817100 | 3" length, 0.05" diameter |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo | 28904 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
Vortex | Sigma | Z258415 | |
Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 |