在这里,我们描述了一种协议,即扩展内皮细胞培养方法(EECM),该方法允许多能干细胞分化为脑微血管内皮细胞(BMEC)样细胞。这些细胞表现出内皮细胞粘附分子表达,因此是适合在体外研究免疫细胞相互作用的人血脑屏障模型。
血脑屏障(BBB)功能障碍是影响中枢神经系统(CNS)的许多神经退行性和神经炎症性疾病的病理标志。由于获得与疾病相关的BBB样本的机会有限,BBB功能障碍是否是疾病发展的病因,还是神经炎症或神经退行性过程的结果,仍然没有得到很好的理解。因此,人类诱导多能干细胞(hiPSCs)为建立来自健康供体和患者的体 外 BBB模型提供了新的机会,从而研究个体患者的疾病特异性BBB特征。已经建立了几种分化方案,用于从hiPSC衍生脑微血管内皮细胞(BMEC)样细胞。对于正确选择相应的BMEC分化方案,必须考虑特定的研究问题。在这里,我们描述了扩展内皮细胞培养方法(EECM),该方法经过优化以将hiPSC分化为具有成熟免疫表型的BMEC样细胞,从而可以研究免疫细胞 – BBB相互作用。在该协议中,hiPSCs首先通过激活Wnt/β-连环蛋白信号分化为内皮祖细胞(EPC)。然后将含有平滑肌样细胞(SMLC)的培养物依次传代以提高内皮细胞(ECs)的纯度并诱导BBB特异性特性。EECM-BMEC与这些SMLC或来自SMLC的条件培养基共培养允许EC粘附分子的可重复,组成和细胞因子调节表达。重要的是,EECM-BMEC样细胞建立了与原代人BMEC相当的屏障特性,并且由于它们表达所有EC粘附分子,EECM-BMEC样细胞与其他hiPSC衍生 的体外 BBB模型不同。因此,EECM-BMEC样细胞是研究BBB水平疾病过程潜在影响的首选模型,以个性化方式影响免疫细胞相互作用。
中枢神经系统 (CNS) 中的神经血管单位 (NVU) 由高度特化的微血管内皮细胞 (EC)、嵌入内皮基底膜的周细胞以及实质基底膜和星形胶质细胞末端足1 组成。在NVU中,脑微血管内皮细胞(BMEC)是形成血脑屏障(BBB)的关键组成部分。与外周器官中的微血管EC相比,BMEC形成复杂且连续的紧密连接,并且具有极低的胞内活性,这使得BBB能够抑制水溶性分子自由细胞旁扩散到CNS。BMEC对特定流入转运蛋白和外排泵的表达确保了分别从CNS2摄取和输出营养物质和有害分子。此外,BBB通过表达对免疫细胞转运到CNS3至关重要的低水平内皮粘附分子来严格控制免疫细胞进入CNS。在生理条件下,BMEC表面粘附分子的表达水平较低,如细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和血管细胞粘附分子-1(VCAM-1),但这些水平在某些神经系统疾病中增加2。BBB的形态和功能分解见于许多神经系统疾病,例如中风4,多发性硬化症(MS)5和几种神经退行性疾病6,7,8。在生理和病理条件下详细研究BMEC的细胞和分子特征是确定靶向BBB的新型治疗策略的一种方法。
直到最近,初级或永生的人类和啮齿动物BMEC被用来研究BBB。然而,基于BBB动物模型的结论是否容易适用于人类BBB尚不清楚,因为几种重要分子(包括粘附分子和溶质载体蛋白)的表达在人类和啮齿动物之间有所不同9,10。尽管像hCMEC/D3这样的人类BMEC系表达适当水平的粘附分子11,但这些永生化的BMEC通常没有复杂的紧密连接和强大的阻隔特性12。初级人类BMEC可用于研究屏障功能13,但并非所有研究人员都可以获得。此外,患者的原发性BMEC可能难以获得,因为它们必须通过仅在特定临床条件下进行的脑活检或手术来收集。
干细胞技术的最新进展允许分化各种人类细胞类型,这些细胞来自人类诱导多能干细胞(hiPSC)等干细胞来源。hiPSC衍生的模型使我们能够使用患者来源的样本建立病理生理模型。可以将几种hiPSC来源的细胞类型组合在一起,以建立更好地模拟生理条件的自体共培养物或类器官。几种广泛使用的方案 14,15,16,17,18,19 可用于区分 hiPSC 衍生的 BMEC 样细胞,这些细胞具有强大的扩散屏障特性,具有 BBB 特异性转运蛋白和外排泵的表达,并且可用于研究小分子的细胞旁扩散、分子转运机制和药物输送到大脑 20,21.然而,先前的研究表明,广泛使用的hiPSC衍生的BMEC样细胞缺乏关键内皮粘附分子的表达,包括VCAM-1,选择素和ICAM-2,它们负责介导免疫细胞与BBB22之间的相互作用。此外,据报道,先前的hiPSC衍生的BMEC在转录水平上显示出混合的内皮和上皮特征23。因此,我们开发了扩展内皮细胞培养方法(EECM),这是一种新颖的方案,允许将hiPSC分化为BMEC样细胞,这些细胞在形态,屏障特征和内皮粘附分子表达方面类似于原代人BMEC。该协议描述了将hiPSCs区分为显示成熟免疫表型的BMEC样细胞的详细方法学程序。
关键点和故障排除
在开始EPC分化之前,研究人员应确保hiPSC培养物中没有发生自发细胞分化事件。没有自发分化的细胞和使用纯hiPSC集落对于获得可重复的结果至关重要。-3 天的 hiPSC 接种密度对于在 MACS 后获得高纯度的 CD31+ EPC 非常重要。每个hiPSC系和每个传代的接种密度可能需要优化。根据 hiPSC 系和传代数,接种密度范围为 75 x 10 3 至 400 x 103 hiPSC,每孔 12 孔板 (20-100 x 103/cm2)。hiPSCs的最小密度检查点是第2天的细胞密度。hiPSC 最迟应在第 2 天达到 100% 汇合度。如果 hiPSC 在第 2 天没有汇合,则 MACS 后 CD31+ EPC 的纯度通常会非常低。在这种情况下,可以增加hiPSC接种密度。如果大量分化细胞在第3天至第5天左右从平板上分离,则初始hiPSC接种密度可能会降低。根据我们的经验,7-8 μM CHIR99021 是此处使用的 hiPSC 系的最佳浓度,但可能需要针对可能对抑制剂处理做出不同反应的其他 hiPSC 系优化浓度。CD31+EPC的纯度应在MACS前后确认。在继续MACS之前,预分选的细胞混合物应为>10%CD31+细胞。CD31+ 细胞百分比为 <6% 通常会导致 MACS 后 EPC <80%。在这种情况下,需要优化初始接种密度和/或CHIR99021浓度。
为了成功选择性传代和生成纯EC单层,CD31 + EPC的MACS后纯度至关重要。如果MACS后的纯度为95%。胶原蛋白包被平板上的EPC接种密度应根据hiPSC线进行优化,以在3-7天内达到100%的汇合度。等到 EC 100% 融合通常会导致成功的选择性通过。然而,即使对于 100% 融合的 EC,一些 hiPSC 线路的 SMLC 也会提前分离。在这种情况下,较低汇合度(例如,≤80%)的选择性传代可能是有效的。如果一些 SMLC 比 EC 更早分离,则通常无法从混合 EC-SMLC 人群中拯救 EC。在这种情况下,缩短传代EC中解离试剂的活化时间和重复选择性传代可能会有所帮助。使用商业解离试剂而不是胰蛋白酶作为解离试剂有利于选择性传代,因为胰蛋白酶不允许EC和SMLC的单独分离。我们使用小分子示踪剂进行的渗透性测定以及对紧密连接和粘附分子表达水平的测试表明,EPC、EECM-BMEC 样细胞和 SMLC 可以在液氮中储存至少 2 年。
该方法的意义和局限性
该方法通过使用化学GSK-3抑制剂激活Wnt/β-连环蛋白信号传导来区分CD31 + EPCs和hiPSC。通过MACS对CD31 + EPC进行阳性选择后,EPC在确定的内皮培养基中培养,促进分化为混合内皮和SMLC群体。这些具有不同粘附特性的混合群体的选择性传代允许EC与SMLC分离。经过一两次传代后,EECM-BMEC样细胞表现出屏障特性和内皮粘附分子的表达,这些分子概括了原代人BMEC的内皮粘附分子。与SMLC或其上清液共培养可诱导细胞因子诱导的VCAM-1表达。
在体内,BBB通过建立分子的低细胞旁和跨细胞通透性,通过特异性转运蛋白运输营养物质和控制免疫细胞运输到CNS来维持CNS稳态。对于BBB的研究,显示感兴趣的相应分子和功能的合适模型是必不可少的。使用来自患者或健康受试者的指定试剂和样品生产EECM-BMEC样细胞可提供可扩展的人类BBB模型。与其他BBB模型相比,使用EECM-BMEC样细胞的模型的优势在于:1)类似于原代人BMEC的形态和内皮转录组谱30;2)存在成熟的紧密连接;3)理想的阻隔性能;4)内皮粘附分子的稳健表达,包括ICAM-1,ICAM-2,VCAM-1,E-和P-选择素,CD99,黑色素瘤细胞粘附分子(MCAM)和活化的白细胞细胞粘附分子(ALCAM)22。因此,该模型对于研究免疫细胞和BMEC之间的相互作用特别有用。尽管EECM-BMEC样细胞的小分子示踪剂的渗透性高于先前报道的iPSC衍生BMEC样细胞的渗透性14,15,但其屏障特性与原代人BMEC的屏障特性相比确实相当好。这种相似性表明EECM-BMEC样细胞可能是BBB的良好体外模型。当使用该模型研究体内缺乏组成型E-选择素表达的非发炎BBB时,必须考虑生理条件下EECM-BMEC样细胞上的E-选择素表达31。在我们之前的研究中,我们证明了EECM-BMEC样细胞可以表型BBB,正如在MS患者的大脑中观察到的关于破坏的紧密连接。这导致小分子的更高通透性和功能粘附分子的表达增加,介导免疫细胞在BMEC样细胞上的粘附和迁移增加32。此外,我们发现Wnt/β-连环蛋白信号传导的激活可以改善MS衍生的EECM-BMEC样细胞中紧密连接的破坏和VCAM-1表达的增加32。这些结果表明,该模型确实有助于研究BBB在神经免疫疾病(如MS)中的作用。
综上所述,EECM-BMEC样细胞是一种有前途的工具,用于深入了解BBB水平的病理生理机制,并作为开发BBB稳定新治疗靶点的工具。在未来,该模型可以应用于研究更广泛疾病的BBB功能障碍,并可能为新的治疗方法开辟途径。
The authors have nothing to disclose.
HN得到了上原纪念基金会,ECTRIMS博士后研究交流奖学金,JSPS在与SNSF(JRPs)联合实施的联合研究计划下的支持。 JPJSJRP20221507和KAKENHI资助号22K15711,JST森林计划(批准号JPMJFR2269,日本),横山临床药理学基金会批准号YRY-2217,金原一郎基金会,成重神经科学研究基金会, 诺华基金会(日本)科学促进基金会和山口大学基金。BE得到了瑞士MS协会和瑞士国家科学基金会(赠款310030_189080和ZLJZ3_214086)以及日本-瑞士战略科学和技术计划(SJSSTP)赠款IZLJZ3_214086的支持。
0.22 mm Syringe filter | TPP | 99722 | |
15 mL Centrifuge tube | Falcon | 352196 | |
40 μm Falcon cell strainer | Falcon | 352340 | |
5 mL Round-bottom tube | SPL | 40005 | |
50 mL Centrifuge tube | Falcon | 352070 | |
96-Well plate, round bottom | SPL | 34096 | |
Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-500ml | |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 695092 | |
Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634 | |
All-in-One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
B-27 Supplement (503), serum free | Thermo Fischer Scientific | 17504044 | |
Bovine serum albumin (BSA), 7.5% in dPBS | Sigma-Aldrich | A8412 | |
CellAdhere Dilution Buffer | STEMCELL Technologies | ST-07183 | |
CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
Chamber slides | Thermo Fischer Scientific | 178599 | |
CHIR99021 | Selleck Chemicals | S1263 | |
Collagen IV from human placenta | Sigma-Aldrich | C5533 | |
Corning tissue culture plates (12-well) | Corning | 3512 | |
Corning tissue culture plates (6-well) | Corning | 3506 | |
Cryo tube innercap 2.0 mL | Watson | 1396-201S | |
Dimethylsulfoxide (DMSO), sterile | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM (13), [+] 4.5 g/L D-glucose, [-] L-glutamine, [-] pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 31053-028 | |
Dulbecco’s (d) PBS (without calcium, magnesium) | Thermo Fisher | 14190250 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/nutrient mixture F-12 (DMEM-F12) | Thermo Fischer Scientific | 11320074 | |
EasySepFITC Positive Selection Kit II | STEMCELL Technologies | 18558 | |
EasySepMagnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid Solution0.02% in DPBS | Sigma | E8008-100ML | |
Fetal Bovine Serum, qualified | Thermo Fischer Scientific | 10270106 | |
Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Ficoll-Paque PLUS | Sigma-Aldrich | GE17144002 | |
FIJI software (Version 2.0.0) | Image J, USA | ||
FlowJo version10 | BD | ||
Fluorescein sodium salt | Sigma-Aldrich | F6377 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fischer Scientific | 35050-061 | |
Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | G6257 | |
HCL | Sigma-Aldrich | H1758 | |
HEPES buffer solution | Thermo Fischer Scientific | 15630-056 | |
Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM) | Thermo Fischer Scientific | 11111-044 | |
Human fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Tocris | 233-FB-500 | |
iPS human induced pluripotent stem cells | Riken RBC | HPS1006 | |
Kanamycin Sulfate (100x) | Thermo Fischer Scientific | 15160-047 | |
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | |
L-Glutamine 200 mM (1003) | Thermo Fischer Scientific | 25030-024 | |
Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | |
MEM NEAA (1003) | Thermo Fischer Scientific | 11140-035 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | |
mTeSR Plus-cGMP | STEMCELL Technologies | ST-100-0276 | |
mTeSR1 complete kit (basal medium plus 53 supplement) | STEMCELL Technologies | 85850 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | |
Paraformaldehyde | Millipore | 104005 | |
Pen Strep | Thermo Fischer Scientific | 15140-122 | |
Recombinant Human IFN-gamma Protein | R&D Systems | 285-IF-100 | |
Recombinant Human IL-2 | BD Biosciences | 554603 | |
Recombinant Human TNF-alpha Protein | R&D Systems | 210-TA-020 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | |
RPMI medium 1640 | Thermo Fischer Scientific | 21875-034 | |
Scalpel | FEATHER | 2975-11 | |
Skim milk | BD Biosciences | 232100 | |
Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | 71290 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fischer Scientific | 11360-039 | |
Transwells, PC Membrane, 0.4 mm, 12 mm, TC-Treated | Corning | 3401 | |
Tris base | Sigma-Aldrich | 93362 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
Vitronectin XF | STEMCELL Technologies | 078180 | |
Water, sterile, cell culture | Sigma-Aldrich | W3500 |