Implantation d’une minipompe osmotique pour augmenter la concentration de glucose dans le liquide céphalorachidien de souris
Summary
Cet article décrit un protocole détaillé pour augmenter la concentration de glucose dans le liquide céphalorachidien (LCR) des souris. Cette approche peut être utile pour étudier les effets d’une glycémie élevée dans le LCR sur la neurodégénérescence, la cognition et le métabolisme périphérique du glucose chez la souris.
Abstract
Le diabète augmente le risque de déclin cognitif et altère la fonction cérébrale. Que cette relation entre une glycémie élevée et des déficits cognitifs soit causale ou non reste insaisissable. De plus, on ne sait pas non plus si ces déficits sont médiés par une augmentation des taux de glucose dans le liquide céphalorachidien (LCR) et / ou le sang. Il existe très peu d’études portant sur les effets directs des taux élevés de glucose dans le LCR sur la fonction du système nerveux central (SNC), en particulier sur l’apprentissage et la mémoire, car les modèles actuels du diabète ne sont pas suffisamment développés pour répondre à de telles questions de recherche. Cet article décrit une méthode pour augmenter chroniquement les niveaux de glucose dans le LCR pendant 4 semaines en perfusant continuellement du glucose dans le ventricule latéral à l’aide de minipompes osmotiques chez la souris. Le protocole a été validé en mesurant les niveaux de glucose dans le LCR. Ce protocole a augmenté les niveaux de glucose du LCR à ~328 mg / dL après perfusion d’une solution de glucose à 50% à un débit de 0,25 μL / h, par rapport à une concentration de glucose dans le LCR de ~ 56 mg / dL chez les souris ayant reçu du liquide céphalorachidien artificiel (aLCR). De plus, ce protocole n’a pas affecté la glycémie. Par conséquent, cette méthode peut être utilisée pour déterminer les effets directs d’une glycémie élevée dans le LCR sur la fonction cérébrale ou une voie neuronale spécifique indépendamment des changements dans les niveaux de glucose dans le sang. Dans l’ensemble, l’approche décrite ici facilitera le développement de modèles animaux pour tester le rôle d’une glycémie élevée dans le LCR dans la médiation des caractéristiques de la maladie d’Alzheimer et / ou d’autres troubles neurodégénératifs associés au diabète.
Introduction
Le diabète de type 1 et de type 2 altère les fonctions cérébrales 1,2,3. Par exemple, le diabète augmente le risque de déclin cognitif et de troubles neurodégénératifs, y compris la maladie d’Alzheimer 3,4. De plus, les personnes atteintes de diabète ont une détection de glucose défectueuse dans le cerveau 5,6. Ce défaut contribue à la pathogenèse de l’hypoglycémie associée à l’inconscience et à une réponse contre-réglementaire insuffisante à l’hypoglycémie7,8, qui peut être fatale si elle n’est pas traitée immédiatement.
Étant donné que le diabète augmente le taux de glucose dans le sang ainsi que dans le liquide céphalorachidien (LCR)9, il est important de déterminer si l’un de ces facteurs ou les deux contribuent à une altération de la fonction cérébrale. La question de savoir si le diabète provoque des lésions cérébrales par une glycémie élevée dans le LCR seul ou en combinaison avec d’autres facteurs tels que la carence en insuline ou la résistance à l’insuline reste également ouverte. Les modèles animaux de diabète de type 1 et de type 2 montrent un déclin cognitif et une neurodégénérescence en plus d’un bilan énergétique affecté et d’un métabolisme périphérique du glucose10,11,12,13. Cependant, à partir de ces modèles, il n’est pas possible de dissocier les effets sélectifs d’une glycémie élevée dans le LCR par rapport à la médiation des complications du diabète sur la fonction cérébrale.
Ce protocole décrit des méthodes pour développer un modèle murin d’hyperglycorrhachie afin de tester les effets des niveaux de glucose chroniquement élevés dans le LCR sur la fonction cérébrale, l’équilibre énergétique et l’homéostasie du glucose. Le modèle murin développé grâce à cette technique présente un outil pour les études sur le rôle étiologique de l’homéostasie du glucose dérégulée sur la fonction neuronale et comportementale.
Par conséquent, l’approche proposée sera utile pour comprendre les effets directs des taux élevés de glucose dans le LCR dans diverses conditions physiopathologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article rapporte un protocole détaillé pour augmenter la glycémie du LCR chez la souris en utilisant des minipompes osmotiques connectées à une canule implantée dans le ventricule latéral. La perfusion chronique de glucose dans le cerveau de la souris par cette procédure sera utile pour délimiter les effets de l’hyperglycorrhachie à long terme sur la cognition, le métabolisme systémique du glucose et l’équilibre énergétique et pour mieux comprendre la pathogenèse des complications du diabète.
…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Subvention DK124619 des National Institutes of Health à KHC.
Fonds de démarrage et prix de recherche pilote, Département de médecine, Université de Rochester, NY, à KHC.
Le Del Monte Institute for Neuroscience Pilot Research Award, Université de Rochester, à KHC.
Prix de recherche universitaire, Bureau du vice-président pour la recherche, Université de Rochester, NY, à KHC.
MUR a conçu et exécuté la méthode, analysé les résultats, préparé des graphiques et des figures, et écrit et édité le manuscrit. KHC a conçu et supervisé l’étude, analysé les résultats, écrit et édité le manuscrit. KHC est le garant de ce travail. Tous les auteurs ont approuvé la version finale du manuscrit.
Materials
| 0.22 µm syringe filter | Membrane solutions | SFPES030022S | |
| 1 mL sterile Syringe (Luer-lok tip) | BD | 309628 | |
| 1 mL TB syringe | BD | 309659 | |
| 100 mL Glass beaker | Fisher | N/a | |
| 100% Ethanol (Koptec) | DLI | UN170 | Use 70% dilution to clean the surgery area |
| 50 mL conical tube | Fisher | N/A | |
| Allignment indicator | KOPF | 1905 | |
| Alzet brain infusion kit | DURECT | Kit # 3; 0008851 | Cut tubing in the kit to 1 inch length |
| Alzet osmotic pump | DURECT | 2004 | Flow rate 0.25 µL/h |
| Anesthesia system | Kent Scientific | SomnoSuite | |
| Betadine solution | Avrio Health | N/A | |
| CaCl2 . 2H2O | Fisher | C79-500 | |
| Cannula holder | KOPF | 1966 | |
| Centering scope | KOPF | 1915 | |
| Dental Cement Liquid | Lang Dental | REF1404 | |
| Dental cement Powder | Lang Dental | REF1220-C | |
| D-glucose | Sigma | G8270 | |
| Electric drill | KOPF | 1911 | While drilling a hole avoid rupturing dura mater |
| Eye lubricant (Optixcare) | CLC Medica | N/A | |
| Glass Bead sterilizer (Germinator 500) | VWR | 101326-488 | Place instruments in sterile water to let them cool before surgery |
| Glucose Assay Kit | Cayman chemical | 10009582 | |
| H2O2 | Sigma | H1009-500ml | Apply 3% H2O2 on skull surface to make the cranial sutures visible. |
| Hair Clipper | WAHL | N/A | |
| heating pad | Heatpax | 19520483 | |
| Hemostat | N/A | N/A | |
| Isoflurane (Fluriso) | Zoetis | NDC1385-046-60 | |
| KCl | VWR | 0395-500g | |
| Magnetic stand | WPI | M1 | |
| Magnifying desk lamp | Brightech | LightView Pro Flex 2 | |
| Metal Spatula | N/A | N/A | |
| MgCl2 . 6H2O | Fisher | BP214-500 | |
| Micromanipulator (Right handed) | WPI | M3301R | |
| Micromanipulator with digital display | KOPF | 1940 | |
| Na2HPO4 . 7H2O | Fisher | S373-500 | |
| NaCl | Sigma | S7653-5Kg | |
| NaH2PO4 . H2O | Fisher | S369-500 | |
| Neosporin | Johnson & Johnson | N/A | Apply topical oinment to prevent infection |
| Parafilm | Bemis | DM-999 | |
| Rimadyl (Carprofen) 50mg/ml | Zoetis | N/A | 5 mg/kg, subcutaneous, for analgesia |
| Scalpel | N/A | N/A | |
| Stereotaxic allignment system | KOPF | 1900 | |
| Sterile 27 gauge needle | BD | 305109 | |
| Sterile cotton tip applicators (Solon) | AMD Medicom | 56200 | |
| Sterile nylon sutures (5.0) | Oasis | MV-661 | Use non-absorable suture for closing the wound |
| Sterile sharp scissors | N/A | N/A | |
| Sterile surgical blades | VWR | 55411-050 | |
| Surgical gloves (Nitrile) | Ammex | N/A | Change gloves if there is suspision of contamination |
| Tray | N/A | N/A |
Referências
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