عزل وثقافة البلاعم الزليلية الأولية والخلايا الليفية من أنسجة التهاب المفاصل الفئران
Summary
توفر الدراسة الحالية بروتوكولا معدلا لعزل الضامة الزليلية والخلايا الليفية من أنسجة التهاب المفاصل الالتهابي في الفئران.
Abstract
التهاب المفاصل الروماتويدي هو أحد أمراض المناعة الذاتية التي تؤدي إلى التهاب مزمن في المفاصل. تلعب البلاعم الزليلية والخلايا الليفية الزليلية أدوارا مركزية في التسبب في التهاب المفاصل الروماتويدي. من المهم فهم وظائف كل من مجموعات الخلايا للكشف عن الآليات الكامنة وراء التقدم المرضي والمغفرة في التهاب المفاصل الالتهابي. بشكل عام ، يجب أن تحاكي الظروف التجريبية في المختبر البيئة في الجسم الحي قدر الإمكان. تم استخدام الخلايا المشتقة من الأنسجة الأولية في التجارب التي تميز الخلايا الليفية الزليلية في التهاب المفاصل. في المقابل ، في التجارب التي تبحث في الوظائف البيولوجية للبلاعم في التهاب المفاصل الالتهابي ، تم استخدام خطوط الخلايا ، والبلاعم المشتقة من نخاع العظم ، والبلاعم المشتقة من الدم الوحيد. ومع ذلك ، فمن غير الواضح ما إذا كانت هذه الضامة تعكس بالفعل وظائف الضامة المقيمة في الأنسجة. للحصول على الضامة المقيمة ، تم تعديل البروتوكولات السابقة لعزل وتوسيع كل من الضامة الأولية والخلايا الليفية من الأنسجة الزليلية في نموذج فأر التهاب المفاصل الالتهابي. قد تكون هذه الخلايا الزليلية الأولية مفيدة للتحليل في المختبر لالتهاب المفاصل.
Introduction
التهاب المفاصل الروماتويدي (RA) هو أحد أمراض المناعة الذاتية التي تتميز بتضخم الغشاء الزليلي ، مما يؤدي إلى تدمير المفاصل 1,2. توجد البلاعم والخلايا الليفية المقيمة في الأنسجة في الغشاء الزليلي الصحي للحفاظ على توازن المفاصل. في مرضى التهاب المفاصل الروماتويدي ، تتكاثر الخلايا الليفية الزليلية (SFs) ، وتتسلل الخلايا المناعية ، بما في ذلك الخلايا الوحيدة ، إلى الغشاء الزليلي وسائل المفاصل ، وهي عمليات مرتبطة بالالتهاب1،3،4. يتم تنشيط الضامة الزليلية (SMs) ، والتي تشمل الضامة المقيمة والبلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة في الدم المحيطي ، و SFs بشكل شاذ ولها أدوار مهمة في التسبب في التهاب المفاصل الروماتويدي. اقترحت الدراسات الحديثة أن تفاعلات الخلايا الخلوية بين SMs و SFs تساهم في كل من تفاقم ومغفرة RA 5,6.
لفهم التسبب في التهاب المفاصل الروماتويدي ، تم استخدام العديد من نماذج القوارض من التهاب المفاصل الالتهابي ، بما في ذلك التهاب المفاصل في مصل K / BxN ، والتهاب المفاصل الناجم عن الكولاجين ، والتهاب المفاصل الناجم عن الأجسام المضادة للكولاجين. المقايسات القائمة على الخلايا مطلوبة بشكل عام لتوضيح الوظائف الجزيئية في التهاب المفاصل. لذلك ، تم عزل الخلايا الأولية من النماذج الحيوانية لالتهاب المفاصل. طريقة عزل SFs من أنسجة التهاب المفاصل الفئران راسخة ، وقد ساهمت هذه الخلايا في توضيح الآليات الجزيئية في التسبب في التهاب المفاصل 7,8. من ناحية أخرى ، غالبا ما تستخدم الضامة المشتقة من نخاع العظم ، والبلاعم المشتقة من الدم الأحادي ، وخطوط خلايا البلاعم كموارد للبلاعم لدراسات التهاب المفاصل9،10. نظرا لأن البلاعم يمكن أن تكتسب وظائف مرتبطة ببيئتها المكروية ، فقد تفتقر المصادر العامة للبلاعم إلى استجابات خاصة بأنسجة التهاب المفاصل. بالإضافة إلى ذلك ، من الصعب الحصول على ما يكفي من الخلايا الزليلية عن طريق الفرز ، لأن الغشاء الزليلي للفئران هو نسيج صغير جدا حتى في نماذج التهاب المفاصل. كان عدم استخدام البلاعم الزليلية للدراسات في المختبر قيدا في دراسات التهاب المفاصل. سيكون إنشاء بروتوكول لعزل وتوسيع الضامة الزليلية ميزة لتوضيح الآليات المرضية في التهاب المفاصل الروماتويدي.
في الطريقة السابقة لعزل SFs ، تم تجاهل SMs7. إلى جانب ذلك ، تم الإبلاغ عن طريقة لعزل وتوسيع الضامة المقيمة من بعض الأعضاء11. لذلك ، تم تعديل البروتوكولات الحالية مجتمعة. يهدف التعديل إلى تحقيق الثقافة الأولية لكل من SMs و SFs بنقاوة عالية. الهدف العام من هذه الطريقة هو عزل وتوسيع كل من SMs و SFs من أنسجة التهاب المفاصل الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعمل هذه الطريقة التي تم تطويرها هنا على تحسين التقنيات السابقة لعزل كل من SFs من التهاب المفاصل في الفئران والبلاعم المقيمة من عدد من الأعضاء7،11. يمكن للطريقة المعدلة عزل كل من الضامة والخلايا الليفية من الغشاء الزليلي الالتهابي بنقاوة عالية ، وهي بسيطة وقا…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون الموظفين في قسم دعم البحوث الطبية ، ومركز دعم البحوث المتقدمة (ADRES) ، وأعضاء قسم الفيزيولوجيا المرضية التكاملية ، مركز علوم البروتينات (PROS) ، جامعة إهيمه ، على مساعدتهم الفنية ودعمهم المفيد. تم دعم هذه الدراسة جزئيا من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) KAKENHI منح JP17K17929 ، JP19K16015 ، JP21K05974 (إلى NS) و JP23689066 ، JP15H04961 ، JP15K15552 ، JP17K19728 ، JP19H03786 (إلى YI) ؛ منح من مؤسسة أوساكا للبحوث الطبية للأمراض المستعصية ، ومؤسسة ناكاتومي ، والجمعية اليابانية لأبحاث العظام والمعادن (JSBMR) منحة النجوم الصاعدة ، ومؤسسة سوميتومو ، ومؤسسة سينشين للبحوث الطبية ، ومؤسسة موتشيدا التذكارية (إلى NS) ؛ ومنحة مؤسسة تاكيدا للعلوم للبحوث الطبية، ومنحة مشروع UCB Japan (UCBJ)، ومنحة JSBMR Frontier Scientist لعام 2019 (إلى YI).
Materials
| 5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution | nacalai tesque | 35556-44 | Diluted with HBSS |
| Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Butterfly needle | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µm pore, Nylon |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collagen |
| Centriguge tube 15 | TPP | 91014 | 15 mL tube |
| Centriguge tube 50 | TPP | 91050 | 50 mL tube |
| Collagenase from C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Heat inactivation was performed |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Tissue culture dish 40 | TPP | 93040 | For cell culture |
| Tissue culture dish 60 | TPP | 92006 | For cell culture |
| Tweezers | KFI | 1-9749-31 | Fine-point |
| Tweezers | Bio Research Center | PRI28-1522 | Serrated tip |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscope |
Referências
- Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B. Rheumatoid arthritis. Lancet. 388 (10055), 2023-2038 (2016).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2205-2219 (2011).
- Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. Synovial tissue macrophages: friend or foe. RMD Open. 3 (2), (2017).
- Hannemann, N., Apparailly, F., Courties, G. Synovial macrophages: from ordinary eaters to extraordinary multitaskers. Trends in Immunology. 42 (5), 368-371 (2021).
- Alivernini, S., et al. Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis. Nature Medicine. 26 (8), 1295-1306 (2020).
- Saeki, N., Imai, Y. Reprogramming of synovial macrophage metabolism by synovial fibroblasts under inflammatory conditions. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 188 (2020).
- Armaka, M., Gkretsi, V., Kontoyiannis, D., Kollias, G. A standardized protocol for the isolation and culture of normal and arthritogenic murine synovial fibroblasts. Protocol Exchange. , (2009).
- Saeki, N., et al. Epigenetic regulator UHRF1 orchestrates proinflammatory gene expression in rheumatoid arthritis in a suppressive manner. The Journal of Clinical Investigation. 132 (11), (2022).
- Midwood, K., et al. Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease. Nature Medicine. 15 (7), 774-780 (2009).
- You, D. G., et al. Metabolically engineered stem cell-derived exosomes to regulate macrophage heterogeneity in rheumatoid arthritis. Science Advances. 7 (23), 0083 (2021).
- Ogawa, K., Tsurutani, M., Hashimoto, A., Soeda, M. Simple propagation method for resident macrophages by co-culture and subculture, and their isolation from various organs. BMC Immunology. 20 (1), 34 (2019).
- Andrä, I., et al. An evaluation of T-cell functionality after flow cytometry sorting revealed p38 MAPK activation. Cytometry Part A. 97 (2), 171-183 (2020).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry Part A. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llorente, I., García-Castañeda, N., Valero, C., González-Álvaro, I., Castañeda, S. Osteoporosis in rheumatoid arthritis: dangerous liaisons. Frontiers in Medicine. 7, 601618 (2020).
- Croft, A. P., et al. Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis. Nature. 570 (7760), 246-251 (2019).
- Wei, K., et al. Notch signalling drives synovial fibroblast identity and arthritis pathology. Nature. 582 (7811), 259-264 (2020).
