Isolering og dyrkning af primære synoviale makrofager og fibroblaster fra murine arthritisvæv
Summary
Denne undersøgelse giver en modificeret protokol til isolering af synoviale makrofager og fibroblaster fra murine inflammatorisk arthritisvæv.
Abstract
Reumatoid arthritis er en autoimmun sygdom, der fører til kronisk betændelse i leddene. Synoviale makrofager og synoviale fibroblaster har centrale roller i patogenesen af reumatoid arthritis. Det er vigtigt at forstå begge cellepopulationers funktioner for at afsløre mekanismerne bag patologisk progression og remission ved inflammatorisk arthritis. Generelt bør in vitro-forsøgsbetingelser efterligne in vivo-miljøet så meget som muligt. Primære vævsafledte celler er blevet anvendt i forsøg, der karakteriserer synoviale fibroblaster i arthritis. I modsætning hertil er der i eksperimenter, der undersøger makrofagernes biologiske funktioner i inflammatorisk arthritis, cellelinjer, knoglemarvsafledte makrofager og blodmonocytafledte makrofager blevet anvendt. Det er imidlertid uklart, om sådanne makrofager faktisk afspejler funktionerne i vævsresidente makrofager. For at opnå residente makrofager blev tidligere protokoller ændret til at isolere og udvide både primære makrofager og fibroblaster fra synovialvæv i en inflammatorisk arthritis musemodel. Disse primære synoviale celler kan være nyttige til in vitro analyse af inflammatorisk arthritis.
Introduction
Reumatoid arthritis (RA) er en autoimmun sygdom karakteriseret ved hyperplasi af synovium, hvilket fører til fælles ødelæggelse 1,2. Vævsresidente makrofager og fibroblaster er til stede i sundt synovium for at opretholde fælles homeostase. Hos RA-patienter spredes synoviale fibroblaster (SF’er), og immunceller, herunder monocytter, infiltreres i synovium og ledvæske, processer forbundet med inflammation 1,3,4. Synoviale makrofager (SM’er), som inkluderer residente makrofager og perifere blodmonocytafledte makrofager, og SF’er aktiveres afvigende og har vigtige roller i RA-patogenese. Nylige undersøgelser har antydet, at celle-celle-interaktioner mellem SM’er og SF’er bidrager til både forværring og remission af RA 5,6.
For at forstå RA-patogenese er der anvendt flere gnavermodeller af inflammatorisk arthritis, herunder K / BxN serumoverførselsarthritis, kollageninduceret arthritis og kollagenantistofinduceret arthritis. Cellebaserede assays er generelt nødvendige for at afklare molekylære funktioner i arthritis. Derfor er primære celler fra dyremodeller af arthritis blevet isoleret. Metoden til at isolere SF’er fra murine arthritisvæv er veletableret, og disse celler har bidraget til belysning af molekylære mekanismer i arthritispatogenese 7,8. På den anden side er knoglemarvsafledte makrofager, blodmonocytafledte makrofager og makrofagcellelinjer ofte blevet brugt som makrofagressourcer til arthritisundersøgelser 9,10. Da makrofager kan erhverve funktioner forbundet med deres mikromiljø, kan generelle kilder til makrofager mangle svar, der er specifikke for gigtvæv. Derudover er det svært at få nok synoviale celler ved sortering, da murinsynovium er et meget lille væv selv i arthritismodeller. Manglende brug af synoviale makrofager til in vitro-studier har været en begrænsning i arthritisstudier. Etableringen af en protokol til isolering og udvidelse af synoviale makrofager ville være en fordel for belysning af patologiske mekanismer i RA.
I den tidligere metode til isolering af SF’er blev SM’er kasseret7. Derudover blev der rapporteret en metode til at isolere og udvide residente makrofager fra nogle organer11. Derfor blev eksisterende protokoller ændret i kombination. Ændringen sigter mod at opnå den primære kultur i både SM’er og SF’er med høj renhed. Det overordnede mål med denne metode er at isolere og udvide både SM’er og SF’er fra murine arthritisvæv.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne metode, der er udviklet her, forbedrer tidligere teknikker til isolering af både SF’er fra murine arthritis og residente makrofager fra en række organer 7,11. Den modificerede metode kan isolere både makrofager og fibroblaster fra inflammatorisk synovium med høj renhed, og den er enkel og reproducerbar. Da metoden ikke kræver komplekse instrumenter såsom en cellesorterer, kan enhver udføre den. Desuden undgår den nuværende teknik bekymringer forbun…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker personalet ved Division of Medical Research Support, Advanced Research Support Center (ADRES) og medlemmerne af Division of Integrative Pathophysiology, Proteo-Science Center (PROS), Ehime University, for deres tekniske assistance og hjælpsomme support. Denne undersøgelse blev delvist støttet af Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI-tilskud JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (til NS) og JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (til YI); tilskud fra Osaka Medical Research Foundation for Intractable Diseases, The Nakatomi Foundation, The Japanese Society for Bone and Mineral Research (JSBMR) Rising Stars Grant, The Sumitomo Foundation, SENSHIN Medical Research Foundation, The Mochida Memorial Foundation (til NS); og et Takeda Science Foundation Medical Research-stipendium, UCB Japan (UCBJ) projekttilskud og JSBMR Frontier Scientist-tilskuddet 2019 (til YI).
Materials
| 5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution | nacalai tesque | 35556-44 | Diluted with HBSS |
| Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Butterfly needle | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µm pore, Nylon |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collagen |
| Centriguge tube 15 | TPP | 91014 | 15 mL tube |
| Centriguge tube 50 | TPP | 91050 | 50 mL tube |
| Collagenase from C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Heat inactivation was performed |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Tissue culture dish 40 | TPP | 93040 | For cell culture |
| Tissue culture dish 60 | TPP | 92006 | For cell culture |
| Tweezers | KFI | 1-9749-31 | Fine-point |
| Tweezers | Bio Research Center | PRI28-1522 | Serrated tip |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscope |
Referências
- Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B. Rheumatoid arthritis. Lancet. 388 (10055), 2023-2038 (2016).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2205-2219 (2011).
- Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. Synovial tissue macrophages: friend or foe. RMD Open. 3 (2), (2017).
- Hannemann, N., Apparailly, F., Courties, G. Synovial macrophages: from ordinary eaters to extraordinary multitaskers. Trends in Immunology. 42 (5), 368-371 (2021).
- Alivernini, S., et al. Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis. Nature Medicine. 26 (8), 1295-1306 (2020).
- Saeki, N., Imai, Y. Reprogramming of synovial macrophage metabolism by synovial fibroblasts under inflammatory conditions. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 188 (2020).
- Armaka, M., Gkretsi, V., Kontoyiannis, D., Kollias, G. A standardized protocol for the isolation and culture of normal and arthritogenic murine synovial fibroblasts. Protocol Exchange. , (2009).
- Saeki, N., et al. Epigenetic regulator UHRF1 orchestrates proinflammatory gene expression in rheumatoid arthritis in a suppressive manner. The Journal of Clinical Investigation. 132 (11), (2022).
- Midwood, K., et al. Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease. Nature Medicine. 15 (7), 774-780 (2009).
- You, D. G., et al. Metabolically engineered stem cell-derived exosomes to regulate macrophage heterogeneity in rheumatoid arthritis. Science Advances. 7 (23), 0083 (2021).
- Ogawa, K., Tsurutani, M., Hashimoto, A., Soeda, M. Simple propagation method for resident macrophages by co-culture and subculture, and their isolation from various organs. BMC Immunology. 20 (1), 34 (2019).
- Andrä, I., et al. An evaluation of T-cell functionality after flow cytometry sorting revealed p38 MAPK activation. Cytometry Part A. 97 (2), 171-183 (2020).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry Part A. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llorente, I., García-Castañeda, N., Valero, C., González-Álvaro, I., Castañeda, S. Osteoporosis in rheumatoid arthritis: dangerous liaisons. Frontiers in Medicine. 7, 601618 (2020).
- Croft, A. P., et al. Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis. Nature. 570 (7760), 246-251 (2019).
- Wei, K., et al. Notch signalling drives synovial fibroblast identity and arthritis pathology. Nature. 582 (7811), 259-264 (2020).
