בידוד ותרבית של מקרופאגים סינוביאליים ראשוניים ופיברובלסטים מרקמת דלקת מפרקים מורין
Summary
המחקר הנוכחי מספק פרוטוקול שונה לבידוד מקרופאגים סינוביאליים ופיברובלסטים מרקמת דלקת מפרקים דלקתית מורין.
Abstract
דלקת מפרקים שגרונית היא מחלה אוטואימונית המובילה לדלקת כרונית של המפרקים. מקרופאגים סינוביאליים ופיברובלסטים סינוביאליים ממלאים תפקידים מרכזיים בפתוגנזה של דלקת מפרקים שגרונית. חשוב להבין את תפקידיהן של שתי אוכלוסיות התאים כדי לחשוף את המנגנונים העומדים בבסיס התקדמות פתולוגית והפוגה בדלקת מפרקים דלקתית. באופן כללי, תנאי ניסוי חוץ גופיים צריכים לחקות את הסביבה in vivo ככל האפשר. תאים ראשוניים שמקורם ברקמה שימשו בניסויים המאפיינים פיברובלסטים סינוביאליים בדלקת פרקים. לעומת זאת, בניסויים שחקרו את התפקודים הביולוגיים של מקרופאגים בדלקת מפרקים דלקתית, נעשה שימוש בקווי תאים, מקרופאגים שמקורם במח עצם ומקרופאגים שמקורם במונוציטים בדם. עם זאת, לא ברור אם מקרופאגים כאלה אכן משקפים את תפקודם של מקרופאגים שוכני רקמות. כדי להשיג מקרופאגים מקומיים, פרוטוקולים קודמים שונו כדי לבודד ולהרחיב הן מקרופאגים ראשוניים והן פיברובלסטים מרקמה סינוביאלית במודל עכבר של דלקת מפרקים דלקתית. תאים סינוביאליים ראשוניים אלה עשויים להיות שימושיים לניתוח חוץ גופי של דלקת מפרקים דלקתית.
Introduction
דלקת מפרקים שגרונית (RA) היא מחלה אוטואימונית המאופיינת בהיפרפלזיה של הסינוביום, המובילה להרס מפרקים 1,2. מקרופאגים ופיברובלסטים שומרי רקמות נמצאים בסינוביום בריא כדי לשמור על הומאוסטזיס משותף. בחולי RA, פיברובלסטים סינוביאליים (SFs) מתרבים, ותאים חיסוניים, כולל מונוציטים, מסתננים לתוך סינוביום ונוזל המפרקים, תהליכים הקשורים לדלקת 1,3,4. מקרופאגים סינוביאליים (SMs), הכוללים מקרופאגים תושבים ומקרופאגים היקפיים שמקורם במונוציטים בדם, ו-SFs מופעלים באופן חריג ויש להם תפקידים חשובים בפתוגנזה של RA. מחקרים אחרונים הראו כי אינטראקציות תא-תא בין SMs ו- SFs תורמות הן להחמרה והן להפוגה של RA 5,6.
כדי להבין את הפתוגנזה של RA, נעשה שימוש במספר מודלים של מכרסמים של דלקת מפרקים דלקתית, כולל דלקת מפרקים בנסיוב K/BxN, דלקת מפרקים הנגרמת על ידי קולגן ודלקת מפרקים הנגרמת על ידי נוגדני קולגן. בדיקות מבוססות תאים נדרשות בדרך כלל כדי להבהיר פונקציות מולקולריות בדלקת פרקים. לכן, תאים ראשוניים ממודלים של בעלי חיים של דלקת פרקים בודדו. השיטה לבידוד SFs מרקמת דלקת מפרקים מורין מבוססת היטב, ותאים אלה תרמו להבהרת מנגנונים מולקולריים בפתוגנזה של דלקת פרקים 7,8. מצד שני, מקרופאגים שמקורם במח עצם, מקרופאגים שמקורם במונוציטים בדם וקווי תאי מקרופאגים שימשו לעתים קרובות כמשאבי מקרופאגים למחקרי דלקת פרקים 9,10. מאחר שמקרופאגים יכולים לרכוש תפקודים הקשורים למיקרו-סביבה שלהם, מקורות כלליים של מקרופאגים עשויים להיות חסרים תגובות ספציפיות לרקמת דלקת פרקים. בנוסף, קשה להשיג מספיק תאים סינוביאליים על ידי מיון, כמו סינוביום murine היא רקמה קטנה מאוד אפילו מודלים דלקת פרקים. חוסר השימוש במקרופאגים סינוביאליים למחקרי מבחנה היווה מגבלה במחקרי דלקת פרקים. הקמת פרוטוקול לבידוד והרחבה של מקרופאגים סינוביאליים תהווה יתרון להבהרת מנגנונים פתולוגיים ב- RA.
בשיטה הקודמת לבידוד SFs, SMs הושלכו7. מלבד זאת, דווח על שיטה לבודד ולהרחיב מקרופאגים מקומיים מאיברים מסוימים11. לכן, פרוטוקולים קיימים שונו בשילוב. השינוי נועד להשיג את התרבות העיקרית של SMs ו- SFs עם טוהר גבוה. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבודד ולהרחיב הן SMs והן SFs מרקמת דלקת מפרקים מורין.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה זו שפותחה כאן משפרת טכניקות קודמות לבידוד הן SFs מדלקת מפרקים מורין והן מקרופאגים תושבים ממספר איברים 7,11. השיטה המתוקנת יכולה לבודד הן מקרופאגים והן פיברובלסטים מסינוביום דלקתי עם טוהר גבוה, והיא פשוטה וניתנת לשחזור. מכיוון שהשיטה אינה דורשת מכשירים מו…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לצוות האגף לתמיכה במחקר רפואי, למרכז התמיכה במחקר מתקדם (ADRES), ולחברי החטיבה לפתופיזיולוגיה אינטגרטיבית, מרכז פרוטאו-מדע (PROS), אוניברסיטת אהימה (Ehime), על עזרתם הטכנית ותמיכתם המועילה. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS) מענקי KAKENHI JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (ל- NS) ו- JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (ל- YI); מענקים מקרן המחקר הרפואי של אוסקה למחלות עקשניות, קרן נקטומי, האגודה היפנית לחקר עצמות ומינרלים (JSBMR) מענק כוכבים עולים, קרן סומיטומו, קרן המחקר הרפואי SENSHIN, קרן הזיכרון מוצ’ידה (ל- NS); ומענק מחקר רפואי של קרן המדע טקדה, מענק פרויקט UCB יפן (UCBJ) ומענק JSBMR Frontier Scientist לשנת 2019 (ל-YI).
Materials
| 5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution | nacalai tesque | 35556-44 | Diluted with HBSS |
| Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Butterfly needle | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µm pore, Nylon |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collagen |
| Centriguge tube 15 | TPP | 91014 | 15 mL tube |
| Centriguge tube 50 | TPP | 91050 | 50 mL tube |
| Collagenase from C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Heat inactivation was performed |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Tissue culture dish 40 | TPP | 93040 | For cell culture |
| Tissue culture dish 60 | TPP | 92006 | For cell culture |
| Tweezers | KFI | 1-9749-31 | Fine-point |
| Tweezers | Bio Research Center | PRI28-1522 | Serrated tip |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscope |
Referências
- Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B. Rheumatoid arthritis. Lancet. 388 (10055), 2023-2038 (2016).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2205-2219 (2011).
- Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. Synovial tissue macrophages: friend or foe. RMD Open. 3 (2), (2017).
- Hannemann, N., Apparailly, F., Courties, G. Synovial macrophages: from ordinary eaters to extraordinary multitaskers. Trends in Immunology. 42 (5), 368-371 (2021).
- Alivernini, S., et al. Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis. Nature Medicine. 26 (8), 1295-1306 (2020).
- Saeki, N., Imai, Y. Reprogramming of synovial macrophage metabolism by synovial fibroblasts under inflammatory conditions. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 188 (2020).
- Armaka, M., Gkretsi, V., Kontoyiannis, D., Kollias, G. A standardized protocol for the isolation and culture of normal and arthritogenic murine synovial fibroblasts. Protocol Exchange. , (2009).
- Saeki, N., et al. Epigenetic regulator UHRF1 orchestrates proinflammatory gene expression in rheumatoid arthritis in a suppressive manner. The Journal of Clinical Investigation. 132 (11), (2022).
- Midwood, K., et al. Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease. Nature Medicine. 15 (7), 774-780 (2009).
- You, D. G., et al. Metabolically engineered stem cell-derived exosomes to regulate macrophage heterogeneity in rheumatoid arthritis. Science Advances. 7 (23), 0083 (2021).
- Ogawa, K., Tsurutani, M., Hashimoto, A., Soeda, M. Simple propagation method for resident macrophages by co-culture and subculture, and their isolation from various organs. BMC Immunology. 20 (1), 34 (2019).
- Andrä, I., et al. An evaluation of T-cell functionality after flow cytometry sorting revealed p38 MAPK activation. Cytometry Part A. 97 (2), 171-183 (2020).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry Part A. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llorente, I., García-Castañeda, N., Valero, C., González-Álvaro, I., Castañeda, S. Osteoporosis in rheumatoid arthritis: dangerous liaisons. Frontiers in Medicine. 7, 601618 (2020).
- Croft, A. P., et al. Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis. Nature. 570 (7760), 246-251 (2019).
- Wei, K., et al. Notch signalling drives synovial fibroblast identity and arthritis pathology. Nature. 582 (7811), 259-264 (2020).
