"मुराइन गठिया ऊतक से प्राथमिक श्लेष मैक्रोफेज और फाइब्रोब्लास्ट का अलगाव और संस्कृति"।
Summary
वर्तमान अध्ययन मुराइन भड़काऊ गठिया ऊतक से श्लेष मैक्रोफेज और फाइब्रोब्लास्ट को अलग करने के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल प्रदान करता है।
Abstract
रूमेटोइड गठिया एक ऑटोइम्यून बीमारी है जो जोड़ों की पुरानी सूजन की ओर ले जाती है। संधिशोथ के रोगजनन में श्लेष मैक्रोफेज और श्लेष फाइब्रोब्लास्ट की केंद्रीय भूमिका है। भड़काऊ गठिया में पैथोलॉजिकल प्रगति और छूट के अंतर्निहित तंत्र को प्रकट करने के लिए दोनों सेल आबादी के कार्यों को समझना महत्वपूर्ण है। सामान्य तौर पर, इन विट्रो प्रयोगात्मक स्थितियों को जितना संभव हो सके विवो वातावरण की नकल करनी चाहिए। गठिया में श्लेष फाइब्रोब्लास्ट को चिह्नित करने वाले प्रयोगों में प्राथमिक ऊतक-व्युत्पन्न कोशिकाओं का उपयोग किया गया है। इसके विपरीत, भड़काऊ गठिया में मैक्रोफेज के जैविक कार्यों की जांच करने वाले प्रयोगों में, सेल लाइनें, अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज और रक्त मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज का उपयोग किया गया है। हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या ऐसे मैक्रोफेज वास्तव में ऊतक-निवासी मैक्रोफेज के कार्यों को दर्शाते हैं। निवासी मैक्रोफेज प्राप्त करने के लिए, पिछले प्रोटोकॉल को एक भड़काऊ गठिया माउस मॉडल में श्लेष ऊतक से प्राथमिक मैक्रोफेज और फाइब्रोब्लास्ट दोनों को अलग करने और विस्तारित करने के लिए संशोधित किया गया था। ये प्राथमिक श्लेष कोशिकाएं भड़काऊ गठिया के इन विट्रो विश्लेषण के लिए उपयोगी हो सकती हैं।
Introduction
रुमेटीइड गठिया (आरए) एक ऑटोइम्यून बीमारी है जो सिनोवियम के हाइपरप्लासिया की विशेषता है, जिससे संयुक्त विनाश 1,2 होता है। ऊतक-निवासी मैक्रोफेज और फाइब्रोब्लास्ट संयुक्त होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए स्वस्थ सिनोवियम में मौजूद होते हैं। आरए रोगियों में, श्लेष फाइब्रोब्लास्ट (एसएफ) का प्रसार होता है, और मोनोसाइट्स सहित प्रतिरक्षा कोशिकाएं, सिनोवियम और संयुक्त तरल पदार्थ में घुसपैठ करती हैं, सूजन से जुड़ी प्रक्रियाएं 1,3,4। श्लेष मैक्रोफेज (एसएम), जिसमें निवासी मैक्रोफेज और परिधीय रक्त मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज शामिल हैं, और एसएफ असामान्य रूप से सक्रिय होते हैं और आरए रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हाल के अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि एसएम और एसएफ के बीच सेल-सेल इंटरैक्शन आरए 5,6 के एक्ससेर्बेशन और छूट दोनों में योगदान देता है।
आरए रोगजनन को समझने के लिए, भड़काऊ गठिया के कई कृंतक मॉडल का उपयोग किया गया है, जिसमें के / बीएक्सएन सीरम ट्रांसफर गठिया, कोलेजन-प्रेरित गठिया और कोलेजन एंटीबॉडी-प्रेरित गठिया शामिल हैं। गठिया में आणविक कार्यों को स्पष्ट करने के लिए आमतौर पर सेल-आधारित परख की आवश्यकता होती है। इसलिए, गठिया के पशु मॉडल से प्राथमिक कोशिकाओं को अलग किया गया है। म्यूरिन गठिया ऊतक से एसएफ को अलग करने की विधि अच्छी तरह से स्थापित है, और इन कोशिकाओं ने गठिया रोगजनन 7,8 में आणविक तंत्र के स्पष्टीकरण में योगदान दिया है। दूसरी ओर, अस्थि मज्जा-व्युत्पन्न मैक्रोफेज, रक्त मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज, और मैक्रोफेज सेल लाइनों को अक्सर गठिया अध्ययन 9,10 के लिए मैक्रोफेज संसाधनों के रूप में उपयोग किया जाता है। चूंकि मैक्रोफेज अपने माइक्रोएन्वायरमेंट से जुड़े कार्यों को प्राप्त कर सकते हैं, मैक्रोफेज के सामान्य स्रोतों में गठिया ऊतक के लिए विशिष्ट प्रतिक्रियाओं की कमी हो सकती है। इसके अलावा, छंटाई करके पर्याप्त श्लेष कोशिकाओं को प्राप्त करना मुश्किल है, क्योंकि मुराइन सिनोवियम गठिया मॉडल में भी एक बहुत छोटा ऊतक है। इन विट्रो अध्ययनों के लिए श्लेष मैक्रोफेज के उपयोग की कमी गठिया अध्ययनों में एक सीमा रही है। श्लेष मैक्रोफेज को अलग करने और विस्तार ति करने के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना आरए में पैथोलॉजिकल तंत्र के स्पष्टीकरण के लिए एक लाभ होगा।
एसएफ को अलग करने की पिछली विधि में,एसएम को 7 छोड़ दिया गया था। इसके अलावा, कुछ अंगों से निवासी मैक्रोफेज को अलग करने और विस्तार ति करने की एकविधि की सूचना दी गई थी। इसलिए, मौजूदा प्रोटोकॉल संयोजन में संशोधित किए गए थे। संशोधन का उद्देश्य उच्च शुद्धता के साथ एसएम और एसएफ दोनों की प्राथमिक संस्कृति को प्राप्त करना है। इस विधि का समग्र लक्ष्य म्यूरिन गठिया ऊतक से एसएम और एसएफ दोनों को अलग और विस्तारित करना है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां विकसित यह विधि कई अंगों से मुराइन गठिया और निवासी मैक्रोफेज दोनों एसएफ को अलग करने के लिए पिछली तकनीकों मेंसुधार करती है। संशोधित विधि मैक्रोफेज और फाइब्रोब्लास्ट दोनों क?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक मेडिकल रिसर्च सपोर्ट डिवीजन, एडवांस्ड रिसर्च सपोर्ट सेंटर (एडीआरईएस) और डिवीजन ऑफ इंटीग्रेटिव पैथोफिज़ियोलॉजी, प्रोटियो-साइंस सेंटर (प्रोस), एहिम विश्वविद्यालय के सदस्यों को उनकी तकनीकी सहायता और सहायक समर्थन के लिए धन्यवाद देते हैं। इस अध्ययन को जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) काकेन्ही अनुदान JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (एनएस को) और JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (वाईआई को) द्वारा समर्थित किया गया था; ओसाका मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन फॉर इनट्रैक्टेबल डिजीज, द नाकाटोमी फाउंडेशन, द जापानी सोसाइटी फॉर बोन एंड मिनरल रिसर्च (जेएसबीएमआर) राइजिंग स्टार्स ग्रांट, द सुमितोमो फाउंडेशन, सेंशिन मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन, द मोचिदा मेमोरियल फाउंडेशन (एनएस को); और एक टाकेडा साइंस फाउंडेशन मेडिकल रिसर्च अनुदान, यूसीबी जापान (यूसीबीजे) परियोजना अनुदान, और जेएसबीएमआर फ्रंटियर साइंटिस्ट अनुदान 2019 (वाईआई को)।
Materials
| 5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution | nacalai tesque | 35556-44 | Diluted with HBSS |
| Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Butterfly needle | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µm pore, Nylon |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collagen |
| Centriguge tube 15 | TPP | 91014 | 15 mL tube |
| Centriguge tube 50 | TPP | 91050 | 50 mL tube |
| Collagenase from C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Heat inactivation was performed |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Tissue culture dish 40 | TPP | 93040 | For cell culture |
| Tissue culture dish 60 | TPP | 92006 | For cell culture |
| Tweezers | KFI | 1-9749-31 | Fine-point |
| Tweezers | Bio Research Center | PRI28-1522 | Serrated tip |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscope |
Referências
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