Denne studien gir en modifisert protokoll for å isolere synoviale makrofager og fibroblaster fra murine inflammatorisk leddgiktvev.
Revmatoid artritt er en autoimmun sykdom som fører til kronisk betennelse i leddene. Synoviale makrofager og synoviale fibroblaster har sentrale roller i patogenesen ved revmatoid artritt. Det er viktig å forstå funksjonene til begge cellepopulasjoner for å avdekke mekanismene som ligger til grunn for patologisk progresjon og remisjon ved inflammatorisk leddgikt. Generelt bør in vitro eksperimentelle forhold etterligne in vivo-miljøet så mye som mulig. Primære vevsavledede celler har blitt brukt i eksperimenter som karakteriserer synoviale fibroblaster i leddgikt. I motsetning til dette, i eksperimenter som undersøker de biologiske funksjonene til makrofager i inflammatorisk leddgikt, har cellelinjer, benmargsavledede makrofager og blodmonocytavledede makrofager blitt brukt. Det er imidlertid uklart om slike makrofager faktisk gjenspeiler funksjonene til vevsboende makrofager. For å oppnå residente makrofager ble tidligere protokoller modifisert for å isolere og utvide både primære makrofager og fibroblaster fra synovialvev i en inflammatorisk leddgiktmusemodell. Disse primære synovialcellene kan være nyttige for in vitro analyse av inflammatorisk artritt.
Revmatoid artritt (RA) er en autoimmun sykdom preget av hyperplasi av synovium, noe som fører til felles ødeleggelse 1,2. Vevsresidente makrofager og fibroblaster er tilstede i sunn synovium for å opprettholde felles homeostase. Hos RA-pasienter prolifererer synoviale fibroblaster (SF), og immunceller, inkludert monocytter, infiltrerer i synovium og leddvæske, prosesser assosiert med betennelse 1,3,4. Synoviale makrofager (SM), som inkluderer residente makrofager og perifert blodmonocyttavledede makrofager, og SF er aberrant aktivert og har viktige roller i RA-patogenesen. Nylige studier har antydet at celle-celle-interaksjoner mellom SM og SF bidrar til både forverring og remisjon av RA 5,6.
For å forstå RA-patogenesen har flere gnagermodeller av inflammatorisk leddgikt blitt brukt, inkludert K / BxN serumoverføringsartritt, kollagenindusert leddgikt og kollagenantistoffindusert leddgikt. Cellebaserte analyser er generelt nødvendig for å avklare molekylære funksjoner ved leddgikt. Derfor har primære celler fra dyremodeller av leddgikt blitt isolert. Metoden for å isolere SF fra murine artrittvev er godt etablert, og disse cellene har bidratt til å belyse molekylære mekanismer i leddgiktpatogenese 7,8. På den annen side har beinmargsavledede makrofager, blodmonocyttavledede makrofager og makrofagcellelinjer ofte blitt brukt som makrofagressurser for leddgiktstudier 9,10. Siden makrofager kan skaffe seg funksjoner knyttet til deres mikromiljø, kan generelle kilder til makrofager mangle responser som er spesifikke for leddgiktvev. I tillegg er det vanskelig å få nok synoviale celler ved å sortere, da murine synovium er et svært lite vev selv i leddgiktmodeller. Mangelen på bruk av synoviale makrofager for in vitro-studier har vært en begrensning i leddgiktstudier. Etablering av en protokoll for å isolere og utvide synoviale makrofager vil være en fordel for å belyse patologiske mekanismer i RA.
I den forrige metoden for å isolere SF ble SM kassert7. Utover dette ble det rapportert en metode for å isolere og utvide residente makrofager fra noen organer11. Derfor ble eksisterende protokoller modifisert i kombinasjon. Modifikasjonen tar sikte på å oppnå primærkulturen til både SM og SF med høy renhet. Det overordnede målet med denne metoden er å isolere og utvide både SM og SF fra murine artrittvev.
Denne metoden utviklet her forbedrer tidligere teknikker for å isolere både SF fra murine artritt og residente makrofager fra en rekke organer 7,11. Den modifiserte metoden kan isolere både makrofager og fibroblaster fra inflammatorisk synovium med høy renhet, og den er enkel og reproduserbar. Siden metoden ikke krever komplekse instrumenter som en cellesortering, kan hvem som helst utføre den. I tillegg unngår den nåværende teknikken bekymringer forbunde…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker personalet ved Divisjon for medisinsk forskningsstøtte, Advanced Research Support Center (ADRES), og medlemmene av Divisjon for integrert patofysiologi, Proteo-Science Center (PROS), Ehime University, for deres tekniske assistanse og nyttig støtte. Denne studien ble delvis støttet av Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI-tilskudd JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (til NS) og JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (til YI); tilskudd fra Osaka Medical Research Foundation for Intractable Diseases, The Nakatomi Foundation, The Japanese Society for Bone and Mineral Research (JSBMR) Rising Stars Grant, The Sumitomo Foundation, SENSHIN Medical Research Foundation, The Mochida Memorial Foundation (til NS); og et Takeda Science Foundation Medical Research Grant, UCB Japan (UCBJ) prosjektstipend, og JSBMR Frontier Scientist grant 2019 (til YI).
5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution | nacalai tesque | 35556-44 | Diluted with HBSS |
Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
Butterfly needle | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µm pore, Nylon |
Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collagen |
Centriguge tube 15 | TPP | 91014 | 15 mL tube |
Centriguge tube 50 | TPP | 91050 | 50 mL tube |
Collagenase from C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
Fetal bovine serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Heat inactivation was performed |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
Tissue culture dish 40 | TPP | 93040 | For cell culture |
Tissue culture dish 60 | TPP | 92006 | For cell culture |
Tweezers | KFI | 1-9749-31 | Fine-point |
Tweezers | Bio Research Center | PRI28-1522 | Serrated tip |
ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscope |