Выделение и культивирование первичных синовиальных макрофагов и фибробластов из ткани мышиного артрита
Summary
В настоящем исследовании представлен модифицированный протокол выделения синовиальных макрофагов и фибробластов из ткани воспалительного артрита мышей.
Abstract
Ревматоидный артрит – это аутоиммунное заболевание, которое приводит к хроническому воспалению суставов. Синовиальные макрофаги и синовиальные фибробласты играют центральную роль в патогенезе ревматоидного артрита. Важно понимать функции обеих клеточных популяций, чтобы выявить механизмы, лежащие в основе патологического прогрессирования и ремиссии при воспалительном артрите. В целом, условия эксперимента in vitro должны максимально имитировать среду in vivo . Первичные клетки тканевого происхождения были использованы в экспериментах, характеризующих синовиальные фибробласты при артрите. Напротив, в экспериментах, изучающих биологические функции макрофагов при воспалительном артрите, использовались клеточные линии, макрофаги костного мозга и моноцитарные макрофаги крови. Однако неясно, действительно ли такие макрофаги отражают функции тканерезидентных макрофагов. Для получения резидентных макрофагов предыдущие протоколы были модифицированы для выделения и расширения как первичных макрофагов, так и фибробластов из синовиальной ткани в мышиной модели с воспалительным артритом. Эти первичные синовиальные клетки могут быть полезны для анализа воспалительного артрита in vitro .
Introduction
Ревматоидный артрит (РА) – аутоиммунное заболевание, характеризующееся гиперплазией синовиальной оболочки, приводящей к разрушению сустава 1,2. Тканевые резидентные макрофаги и фибробласты присутствуют в здоровой синовиальной оболочке для поддержания гомеостаза суставов. У пациентов с РА синовиальные фибробласты (СФ) пролиферируют, а иммунные клетки, включая моноциты, проникают в синовиальную оболочку и суставную жидкость, процессы, связанные с воспалением 1,3,4. Синовиальные макрофаги (СМ), к которым относятся резидентные макрофаги и моноцитарные макрофаги периферической крови, а также СФ аберрантно активированы и играют важную роль в патогенезе РА. Недавние исследования показали, что межклеточное взаимодействие между СМ и СФ способствует как обострению, так и ремиссии РА 5,6.
Для понимания патогенеза РА было использовано несколько моделей воспалительного артрита грызунов, включая артрит с переносом сыворотки K/BxN, коллаген-индуцированный артрит и артрит, индуцированный антителами к коллагену. Клеточные анализы, как правило, необходимы для выяснения молекулярных функций при артрите. Поэтому первичные клетки животных моделей артрита были выделены. Метод выделения СФ из ткани мышиного артрита хорошо известен, и эти клетки внесли свой вклад в выяснение молекулярных механизмов патогенеза артрита 7,8. С другой стороны, макрофаги, полученные из костного мозга, макрофаги, полученные из моноцитов крови, и клеточные линии макрофагов часто использовались в качестве макрофагальных ресурсов для исследований артрита 9,10. Поскольку макрофаги могут приобретать функции, связанные с их микроокружением, общие источники макрофагов могут отсутствовать реакции, специфичные для тканей артрита. Кроме того, трудно получить достаточное количество синовиальных клеток путем сортировки, так как синовиальная оболочка мышей представляет собой очень маленькую ткань даже в моделях артрита. Отсутствие использования синовиальных макрофагов для исследований in vitro было ограничением в исследованиях артрита. Создание протокола для выделения и расширения синовиальных макрофагов было бы преимуществом для выяснения патологических механизмов при РА.
В предыдущем методе выделения СФ СМ отбрасывались7. Кроме того, сообщалось о способе выделения и распространения резидентных макрофагов из некоторых органов11. Поэтому существующие протоколы модифицировались в комплексе. Модификация направлена на получение первичной культуры как СМ, так и СФ высокой чистоты. Общая цель этого метода состоит в том, чтобы выделить и расширить как SM, так и SF из ткани мышиного артрита.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод, разработанный здесь, является улучшением предыдущих методов выделения как СФ из мышиного артрита, так и резидентных макрофагов из ряда органов 7,11. Модифицированный метод позволяет выделять как макрофаги, так и фибробласты из воспалительной ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят сотрудников Отдела поддержки медицинских исследований Центра поддержки перспективных исследований (ADRES) и членов Отдела интегративной патофизиологии Центра протео-науки (PROS) Университета Эхимэ за их техническую помощь и полезную поддержку. Это исследование было частично поддержано грантами KAKENHI Японского общества содействия науке (JSPS) JP17K17929, JP19K16015, JP21K05974 (для NS) и JP23689066, JP15H04961, JP15K15552, JP17K19728, JP19H03786 (для YI); гранты от Фонда медицинских исследований трудноизлечимых заболеваний Осаки, Фонда Накатоми, Гранта «Восходящие звезды» Японского общества исследований костей и минералов (JSBMR), Фонда «Сумитомо», Фонда медицинских исследований SENSHIN, Мемориального фонда Мочиды (для NS); а также грант Takeda Science Foundation на медицинские исследования, грант проекта UCB Japan (UCBJ) и грант JSBMR Frontier Scientist 2019 (YI).
Materials
| 5.0 g/L Trypsin/5.3 mmol/L EDTA solution | nacalai tesque | 35556-44 | Diluted with HBSS |
| Antibiotic–antimycotic (anti/anti) | Gibco | 15240-062 | |
| Butterfly needle | TERUMO | SV-23DLK | 23G |
| Cell strainer | Falcon | 352340 | 40 µm pore, Nylon |
| Cellmatrix Type I-C | Nitta gelatin | 637-00773 | Type I-C collagen |
| Centriguge tube 15 | TPP | 91014 | 15 mL tube |
| Centriguge tube 50 | TPP | 91050 | 50 mL tube |
| Collagenase from C. Histolyticum | Sigma | C5138 | Type IV collagenase |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium GlutaMax (DMEM) | Gibco | 10569-010 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | SIGAM | 173012 | Heat inactivation was performed |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) | Wako | 085-09355 | |
| Scissors | Bio Research Center | PRI28-1525A | |
| Tissue culture dish 40 | TPP | 93040 | For cell culture |
| Tissue culture dish 60 | TPP | 92006 | For cell culture |
| Tweezers | KFI | 1-9749-31 | Fine-point |
| Tweezers | Bio Research Center | PRI28-1522 | Serrated tip |
| ZEISS Stemi 305 | ZEISS | STEMI305-EDU | Stereomicroscope |
Referências
- Smolen, J. S., Aletaha, D., McInnes, I. B. Rheumatoid arthritis. Lancet. 388 (10055), 2023-2038 (2016).
- McInnes, I. B., Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. The New England Journal of Medicine. 365 (23), 2205-2219 (2011).
- Kurowska-Stolarska, M., Alivernini, S. Synovial tissue macrophages: friend or foe. RMD Open. 3 (2), (2017).
- Hannemann, N., Apparailly, F., Courties, G. Synovial macrophages: from ordinary eaters to extraordinary multitaskers. Trends in Immunology. 42 (5), 368-371 (2021).
- Alivernini, S., et al. Distinct synovial tissue macrophage subsets regulate inflammation and remission in rheumatoid arthritis. Nature Medicine. 26 (8), 1295-1306 (2020).
- Saeki, N., Imai, Y. Reprogramming of synovial macrophage metabolism by synovial fibroblasts under inflammatory conditions. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 188 (2020).
- Armaka, M., Gkretsi, V., Kontoyiannis, D., Kollias, G. A standardized protocol for the isolation and culture of normal and arthritogenic murine synovial fibroblasts. Protocol Exchange. , (2009).
- Saeki, N., et al. Epigenetic regulator UHRF1 orchestrates proinflammatory gene expression in rheumatoid arthritis in a suppressive manner. The Journal of Clinical Investigation. 132 (11), (2022).
- Midwood, K., et al. Tenascin-C is an endogenous activator of Toll-like receptor 4 that is essential for maintaining inflammation in arthritic joint disease. Nature Medicine. 15 (7), 774-780 (2009).
- You, D. G., et al. Metabolically engineered stem cell-derived exosomes to regulate macrophage heterogeneity in rheumatoid arthritis. Science Advances. 7 (23), 0083 (2021).
- Ogawa, K., Tsurutani, M., Hashimoto, A., Soeda, M. Simple propagation method for resident macrophages by co-culture and subculture, and their isolation from various organs. BMC Immunology. 20 (1), 34 (2019).
- Andrä, I., et al. An evaluation of T-cell functionality after flow cytometry sorting revealed p38 MAPK activation. Cytometry Part A. 97 (2), 171-183 (2020).
- Ryan, K., Rose, R. E., Jones, D. R., Lopez, P. A. Sheath fluid impacts the depletion of cellular metabolites in cells afflicted by sorting induced cellular stress (SICS). Cytometry Part A. 99 (9), 921-929 (2021).
- Llorente, I., García-Castañeda, N., Valero, C., González-Álvaro, I., Castañeda, S. Osteoporosis in rheumatoid arthritis: dangerous liaisons. Frontiers in Medicine. 7, 601618 (2020).
- Croft, A. P., et al. Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis. Nature. 570 (7760), 246-251 (2019).
- Wei, K., et al. Notch signalling drives synovial fibroblast identity and arthritis pathology. Nature. 582 (7811), 259-264 (2020).
