SVEM(Designed Mixture-Process Experiments and Self-Validated Ensemble Model)을 사용한 지질 나노입자(LNP) 제형 최적화를 위한 워크플로우
Summary
이 프로토콜은 실험 설계 구성에서 주관적인 선택을 최소화하는 혼합물, 연속 및 범주형 연구 요인에 대한 제형 최적화에 대한 접근 방식을 제공합니다. 분석 단계에서는 효과적이고 사용하기 쉬운 모델링 피팅 절차가 사용됩니다.
Abstract
우리는 과학자들에게 접근 가능한 워크플로우를 제공하는 것을 목표로 지질 나노입자(LNP) 제형을 최적화하기 위한 QbD(Quality by Design) 스타일의 접근 방식을 제시합니다. 이온화 가능, 헬퍼 및 PEG 지질의 몰 비율이 최대 100%까지 합산되어야 하는 이러한 연구의 고유한 제한 사항은 이러한 혼합물 제약 조건을 수용하기 위해 전문화된 설계 및 분석 방법이 필요합니다. LNP 설계 최적화에 일반적으로 사용되는 지질 및 공정 요인에 초점을 맞추고, 공간 충진 설계를 채택하고 최근 개발된 자체 검증 앙상블 모델(SVEM)의 통계적 프레임워크를 활용하여 혼합물 공정 실험의 설계 및 분석에서 전통적으로 발생하는 많은 어려움을 피할 수 있는 단계를 제공합니다. 후보 최적 제형을 생성하는 것 외에도 워크플로는 결과 해석을 단순화하는 적합 통계 모델의 그래픽 요약을 작성합니다. 새로 확인된 후보 제형은 확인 실행으로 평가되며 선택적으로 보다 포괄적인 2상 연구의 맥락에서 수행될 수 있습니다.
Introduction
생체내 유전자 전달 시스템을 위한 지질 나노입자 (LNP) 제형은 일반적으로 이온화 가능, 헬퍼 및 PEG 지질 1,2,3의 범주로부터 4개의 구성 지질을 포함한다. 이들 지질이 단독으로 연구되든 다른 비혼합물 인자와 동시에 연구되든, 이들 제형에 대한 실험은 “혼합물” 설계를 필요로 하는데, 그 이유는 – 후보 제형이 주어지면 – 지질 중 어느 하나의 비율을 증가시키거나 감소시키는 것은 필연적으로 다른 3개의 지질의 비율의 합에서 상응하는 감소 또는 증가로 이어지기 때문이다.
예를 들어, 현재 벤치마크로 취급될 세트 레시피를 사용하는 LNP 제형을 최적화하고 있다고 가정합니다. 목표는 LNP의 효능을 최대화하는 동시에 이차적으로 평균 입자 크기를 최소화하는 것입니다. 실험에서 다양한 연구 요소는 4가지 구성 지질(이온화 가능, 콜레스테롤, DOPE, PEG)의 몰비, N:P 비율, 유속 및 이온화 가능한 지질 유형입니다. 이온화 가능한 지질(콜레스테롤 포함)은 PEG보다 더 넓은 범위의 몰비(10-60%)에 걸쳐 변할 수 있으며, 이는 이 그림에서 1-5%로 변할 것입니다. 벤치마크 제형 레시피와 다른 요인의 범위 및 반올림 세분성은 보충 파일 1에 명시되어 있습니다. 이 예에서 과학자들은 하루에 23번의 런(입자의 고유한 배치)을 수행할 수 있으며 최소 요구 사항을 충족하는 경우 이를 표본 크기로 사용하려고 합니다. 이 실험에 대한 시뮬레이션 결과는 보충 파일 2 및 보충 파일 3에 제공됩니다 .
Rampado와 Peer4는 나노 입자 기반 약물 전달 시스템의 최적화를 위해 설계된 실험 주제에 대한 최근 리뷰 논문을 발표했습니다. Kauffman et al.5은 부분 요인 및 확정 선별 설계를 사용하여 LNP 최적화 연구를 고려했습니다6; 그러나 이러한 유형의 설계는 비효율적인 “슬랙 변수”7를 사용하지 않고는 혼합물 제약조건을 수용할 수 없으며, 혼합물 계수가 존재할 때는 일반적으로 사용되지 않습니다7,8. 대신, 혼합물 제약 조건을 통합할 수 있는 “최적 설계”가 전통적으로 혼합물 공정 실험에 사용된다 9. 이러한 설계는 연구 요인의 사용자 지정 함수를 대상으로 하며 이 함수가 연구 요인과 반응 간의 실제 관계를 포착하는 경우에만 최적입니다(여러 가지 가능한 의미 중 하나에서). 텍스트에는 “최적 설계”와 “최적 제형 후보” 사이에 차이가 있으며, 후자는 통계 모델에 의해 식별된 최상의 제형을 나타냅니다. 최적 설계에는 혼합물 공정 실험에 대한 세 가지 주요 단점이 있습니다. 첫째, 과학자가 목표 모델을 지정할 때 연구 요인의 상호 작용을 예상하지 못하면 결과 모델이 편향되어 열등한 후보 공식을 생성할 수 있습니다. 둘째, 최적 설계는 대부분의 런을 요인 공간의 외부 경계에 배치합니다. LNP 연구에서는 입자가 지질 또는 공정 설정의 극단에서 올바르게 형성되지 않을 경우 많은 수의 실행 손실이 발생할 수 있습니다. 셋째, 과학자들은 종종 반응 표면에 대한 모델 독립적 감각을 얻고 요인 공간의 이전에 탐색되지 않은 영역에서 직접 프로세스를 관찰하기 위해 요인 공간의 내부에서 실험적 실행을 선호합니다.
대안적인 설계 원리는 공간 채우기 설계(10)를 사용하여 (혼합물 제약) 요인 공간의 근사치의 균일한 커버리지를 목표로 하는 것이다. 이러한 설계는 최적 설계9 에 비해 일부 실험 효율성을 희생하지만(전체 요인 공간이 유효한 공식으로 이어진다고 가정할 때), 이 응용 분야에서 유용한 몇 가지 이점을 절충한다. 공간 채우기 설계는 응답 표면의 구조에 대해 선험 적으로 가정하지 않습니다. 이를 통해 연구 요인 간의 예상치 못한 관계를 포착할 수 있는 유연성을 얻을 수 있습니다. 또한 원하는 실행 크기를 조정할 때 추가하거나 제거할 회귀 항을 결정할 필요가 없기 때문에 디자인 생성이 간소화됩니다. 일부 설계점(레시피)으로 인해 공식화가 실패하는 경우 공간 채우기 설계를 사용하면 연구 요인에 대한 고장 경계를 모형화하는 동시에 성공적인 요인 조합에 대한 연구 반응에 대한 통계 모형을 지원할 수 있습니다. 마지막으로, 요인 공간의 내부 커버리지는 반응 표면의 모델 독립적인 그래픽 탐색을 허용합니다.
혼합물 공정 실험의 혼합 계수 부분공간을 시각화하기 위해 특수 삼각형 “삼항 플롯”이 사용됩니다. 그림 1은 이러한 용도를 나타냅니다: 세 가지 성분이 각각 0에서 1 사이의 범위를 허용할 수 있는 점의 큐브에서 성분의 합이 1과 같다는 제약 조건을 만족하는 점이 빨간색으로 강조 표시됩니다. 세 가지 성분에 대한 혼합물 제약 조건은 실현 가능한 요인 공간을 삼각형으로 줄입니다. 4가지 혼합물 성분을 사용하는 LNP 응용 분야에서는 다른 지질의 합을 나타내는 “기타” 축에 대해 한 번에 2개의 지질을 플로팅하여 요인 공간을 나타내는 6개의 서로 다른 삼항 플롯을 생성합니다.
그림 1: 삼각 요인 영역. 정육면체 내의 공간 채우기 그림에서 작은 회색 점은 혼합물 구속조건과 일치하지 않는 공식을 나타냅니다. 더 큰 빨간색 점은 정육면체 내에 새겨진 삼각형에 있으며 혼합물 제약 조건이 충족되는 공식을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
지질 혼합물 요인 외에도 N:P 비율, 완충액 농도 또는 유속과 같은 하나 이상의 연속 공정 요인이 있는 경우가 많습니다. 범주형 인자는 이온화 가능한 지질 유형, 헬퍼 지질 유형, 또는 완충액 유형과 같은 존재할 수 있다. 목표는 생체 내 연구에서 효능의 일부 측정을 최대화하고 입자 크기 및 PDI(다분산 지수) 최소화, 캡슐화 비율 최대화 및 체중 감소와 같은 부작용 최소화와 같은 물리화학적 특성을 개선하는 제형(지질 및 공정 요인 설정의 혼합물)을 찾는 것입니다. 합리적인 벤치마크 레시피에서 시작하는 경우에도 유전자 페이로드의 변화를 감안할 때 또는 공정 요인 또는 지질 유형의 변화를 고려할 때 재최적화에 관심이 있을 수 있습니다.
Cornell7 은 혼합물 및 혼합물 공정 실험의 통계적 측면에 대한 명확한 텍스트를 제공하며, Myers et al.9 는 최적화를 위한 가장 관련성이 높은 혼합물 설계 및 분석 주제에 대한 훌륭한 요약을 제공합니다. 그러나 이러한 작업은 통계적 세부 사항과 전문 용어로 과학자들에게 과부하가 걸릴 수 있습니다. 실험 설계 및 분석을 위한 최신 소프트웨어는 관련 이론에 호소할 필요 없이 대부분의 LNP 최적화 문제를 충분히 지원할 수 있는 강력한 솔루션을 제공합니다. 더 복잡하거나 우선순위가 높은 연구도 통계학자와의 협력을 통해 이익을 얻을 수 있고 공간을 채우는 설계보다는 최적 설계를 사용할 수 있지만, 우리의 목표는 비효율적인 OFAT(one-factor-at-a-time) 테스트11 에 호소하거나 단순히 사양을 충족하는 첫 번째 공식에 안주하지 않고 과학자들의 편안함 수준을 개선하고 LNP 제형의 최적화를 장려하는 것입니다.
이 기사에서는 통계 소프트웨어를 활용하여 일반적인 LNP 배합 문제를 최적화하고 설계 및 분석 문제를 발생하는 순서대로 해결하는 워크플로우를 제공합니다. 실제로 이 방법은 일반적인 최적화 문제에 대해 작동하며 LNP에 국한되지 않습니다. 그 과정에서 발생하는 몇 가지 일반적인 질문이 해결되고 경험과 시뮬레이션 결과에 근거한 권장 사항이 제공됩니다12. 최근 개발된 자체 검증 앙상블 모델(SVEM)13 프레임워크는 혼합 공정 실험의 결과를 분석하는 취약한 접근 방식을 크게 개선했으며, 이 접근 방식을 사용하여 제형 최적화를 위한 단순화된 전략을 제공합니다. 워크플로우는 다른 소프트웨어 패키지를 사용하여 따를 수 있는 일반적인 방식으로 구성되지만, JMP 17 Pro는 혼합 공정 실험의 난해한 분석을 단순화하는 데 필요한 그래픽 요약 도구와 함께 SVEM을 제공한다는 점에서 독특합니다. 따라서 JMP 관련 지침도 프로토콜에 제공됩니다.
SVEM은 기존 접근 방식과 동일한 선형 회귀 모델 기반을 사용하지만, 전방 선택 또는 페널티 선택(올가미) 기본 접근 방식을 사용하여 후보 효과의 “전체 모델”을 맞추는 데 필요한 지루한 수정을 피할 수 있습니다. 또한 SVEM은 데이터에 나타나는 잡음(공정 및 분석 분산)을 통합할 가능성을 최소화하는 개선된 “축소 모형” 적합도를 제공합니다. 모델 13,14,15,16,17,18에서 각 실행의 상대적 중요도를 반복적으로 재가중하여 발생하는 예측된 모델의 평균을 구하는 방식으로 작동합니다. SVEM은 기존의 단발성 회귀 분석보다 구현하기 쉽고 더 나은 품질의 최적 제형 후보를 산출하는 혼합물 공정 실험을 모델링하기 위한 프레임워크를 제공합니다(12,13). SVEM의 수학적 세부 사항은 이 논문의 범위를 벗어나며, 관련 문헌 검토를 넘어서는 피상적인 요약조차도 이 응용 프로그램의 주요 이점인 실무자를 위한 간단하고 강력하며 정확한 클릭 투 런 절차를 허용합니다.
제시된 워크플로우는 의약품 개발에 대한 QbD(Quality by Design)19 접근법과 일치한다20. 이 연구의 결과는 재료 속성과 공정 매개변수를 중요한 품질 속성(CQA)21에 연결하는 기능적 관계에 대한 이해가 될 것입니다. Daniel et al.22 는 RNA 플랫폼 생산을 위해 특별히 QbD 프레임워크를 사용하는 것에 대해 논의합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
혼합물 공정 실험의 설계 및 분석을 위한 최신 소프트웨어를 통해 과학자들은 비효율적인 OFAT 실험을 피하는 구조화된 워크플로우에서 지질 나노입자 제형을 개선할 수 있습니다. 최근에 개발된 SVEM 모델링 접근 방식은 이전에 불필요한 통계적 고려 사항으로 과학자들의 주의를 산만하게 했을 수 있는 많은 난해한 회귀 수정 및 모델 축소 전략을 제거합니다. 일단 결과가 수집되면, SVEM 분석 프레?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
기사를 개선하는 제안에 대해 편집자와 익명의 심사위원에게 감사드립니다.
Referências
- Dolgin, E. Better lipids to power next generation of mRNA vaccines. Science. 376 (6594), 680-681 (2022).
- Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).
- Huang, X., et al. The landscape of mRNA nanomedicine. Nature Medicine. 28, 2273-2287 (2022).
- Rampado, R., Peer, D. Design of experiments in the optimization of nanoparticle-based drug delivery systems. Journal of Controlled Release. 358, 398-419 (2023).
- Kauffman, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticle formulations for mRNA delivery in vivo with fractional factorial and definitive screening designs. Nano Letters. 15, 7300-7306 (2015).
- Jones, B., Nachtsheim, C. J. A class of three-level designs for definitive screening in the presence of second-order effects. Journal of Quality Technology. 43, 1-15 (2011).
- Cornell, J. . Experiments with Mixtures: Designs, Models, and the Analysis of Mixture Data. Wiley Series in Probability and Statistics. , (2002).
- Jones, B. Proper and improper use of definitive screening designs (DSDs). JMP user Community. , (2016).
- Myers, R., Montgomery, D., Anderson-Cook, C. . Response Surface Methodology. , (2016).
- Lekivetz, R., Jones, B. Fast flexible space-filling designs for nonrectangular regions. Quality and Reliability Engineering International. 31, 829-837 (2015).
- Czitrom, V. One-factor-at-a-time versus designed experiments. The American Statistician. 53, 126-131 (1999).
- Karl, A., Wisnowski, J., Rushing, H. JMP Pro 17 remedies for practical struggles with mixture experiments. JMP Discovery Conference. , (2022).
- Lemkus, T., Gotwalt, C., Ramsey, P., Weese, M. L. Self-validated ensemble models for design of experiments. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 219, 104439 (2021).
- Gotwalt, C., Ramsey, P. Model validation strategies for designed experiments using bootstrapping techniques with applications to biopharmaceuticals. JMP Discovery Conference. , (2018).
- Xu, L., Gotwalt, C., Hong, Y., King, C. B., Meeker, W. Q. Applications of the fractional-random-weight bootstrap. The American Statistician. 74 (4), 345-358 (2020).
- Ramsey, P., Levin, W., Lemkus, T., Gotwalt, C. SVEM: A paradigm shift in design and analysis of experiments. JMP Discovery Conference Europe. , (2021).
- Ramsey, P., Gaudard, M., Levin, W. Accelerating innovation with space filling mixture designs, neural networks and SVEM. JMP Discovery Conference. , (2021).
- Lemkus, T. Self-Validated Ensemble modelling. Doctoral Dissertations. 2707. , (2022).
- Juran, J. M. . Juran on Quality by Design: The New Steps for Planning Quality into Goods and Services. , (1992).
- Yu, L. X., et al. Understanding pharmaceutical quality by design. The AAPS Journal. 16, 771 (2014).
- Simpson, J. R., Listak, C. M., Hutto, G. T. Guidelines for planning and evidence for assessing a well-designed experiment. Quality Engineering. 25, 333-355 (2013).
- Daniel, S., Kis, Z., Kontoravdi, C., Shah, N. Quality by design for enabling RNA platform production processes. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1213-1228 (2022).
- Scheffé, H. Experiments with mixtures. Journal of the Royal Statistical Society Series B. 20, 344-360 (1958).
- Brown, L., Donev, A. N., Bissett, A. C. General blending models for data from mixture experiments. Technometrics. 57, 449-456 (2015).
- Herrera, M., Kim, J., Eygeris, Y., Jozic, A., Sahay, G. Illuminating endosomal escape of polymorphic lipid nanoparticles that boost mRNA delivery. Biomaterials Science. 9 (12), 4289-4300 (2021).
- Lemkus, T., Ramsey, P., Gotwalt, C., Weese, M. Self-validated ensemble models for design of experiments. ArXiv. , 2103.09303 (2021).
- Goos, P., Jones, B. . Optimal Design of Experiments: A Case Study Approach. , (2011).
- Rushing, H. DOE Gumbo: How hybrid and augmenting designs can lead to more effective design choices. JMP Discovery Conference. , (2020).
