소 간세포에서 지질 액적 크기 및 융합 평가
Summary
본 프로토콜은 오일 레드 O를 사용하여 지질 방울(LD)을 염색하고, 지방산 유도 지방 간세포 모델에서 LD의 크기와 수를 계산하고, BODIPY 493/503을 사용하여 작은 LD가 큰 LD로 융합되는 과정을 관찰하는 방법을 설명합니다.
Abstract
지질 방울(LD)은 세포의 지질 대사와 중성 지질 저장에 중요한 역할을 하는 세포 소기관입니다. 그들은 비만, 지방간 질환 및 당뇨병과 같은 다양한 대사 질환과 관련이 있습니다. 간세포에서 LD의 크기와 수는 지방간 질환의 징후입니다. 또한, 산화 스트레스 반응, 세포 자가포식 및 세포자멸사는 종종 LD의 크기와 수의 변화를 동반합니다. 결과적으로, LD의 크기와 양은 LD 생물 발생의 메커니즘에 관한 현재 연구의 기초입니다. 여기에서는 지방산 유발 소 간 세포에서 오일 레드 O를 사용하여 LD를 염색하고 LD의 크기와 수를 조사하는 방법을 설명합니다. LD의 크기 분포는 통계적으로 분석됩니다. 작은 LD가 큰 LD로 융합되는 과정은 라이브 셀 이미징 시스템에서도 관찰됩니다. 현재의 연구는 다양한 생리적 조건에서 LD의 크기 변화 추세를 직접 관찰할 수 있는 방법을 제공합니다.
Introduction
간세포에 지질 액적(LD) 축적은 간 섬유증 및 간세포 암종으로 진행될 수 있는 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)의 전형적인 특징입니다. 지방간 질환의 가장 초기 증상은 간세포1의 세포질에 LD가 축적되는 것을 특징으로하는 지방증이라는 것이 밝혀졌습니다. 간 지방증은 항상 LD의 수 증가 및/또는 크기 증가와 관련이 있다2. LD는 중성지방(TG)을 핵심으로 하는 소포체(ER)에서 생성되는 것으로 생각되며, 단백질과 인지질로 둘러싸여 있다3. LD는 TG 저장을 담당하는 세포내 소기관으로서 크기, 수, 지질 조성, 단백질 및 다른 소기관과의 상호 작용과 관련하여 다양한 특징을 나타내며, 이 모든 것이 세포 에너지 항상성에 영향을 미칩니다4. TG 수준은 LD의 크기와 양의 상관관계가 있으며, 세포 내 TG 함량이 높을수록 더 큰 LD를 형성할 수 있다5. LD는 TG의 국소 합성, ER에서의 지질 혼입 및 다중 LD의 융합을 통해 크기가 증가한다6. 큰 LD를 포함하는 세포(지방세포, 간세포 등)는 LD 융합에 의해 효율적으로 지질 저장을 증가시키는 특별한 메커니즘을 가지고 있습니다. LD의 동적 변화는 세포의 다양한 에너지 대사 상태를 반영합니다. 건강한 세포와 비정상 세포에서 다양한 간 LD를 관찰하고 분석할 수 있는 방법론을 개발하는 것이 중요합니다.
LD의 주요 비형광 염료는 수단 블랙 B와 오일 레드 O입니다. 수단 블랙 B는 중성 지질, 인지질 및 스테로이드를 염색합니다7. 오일 레드 O는 주로 골격근, 심근 세포, 간 조직, 지방 세포 등의 LD를 염색하는 데 사용됩니다8., 생쥐와 인간의 간 지방증을 정량적으로 검출하기위한 표준 도구로 간주됩니다9. LD의 동적 변화는 주로 형광 염색에 의해 수행됩니다. 나일 레드와 BODIPY는 모두 일반적으로 사용되는 형광 지질 염료10,11입니다. 나일 레드와 비교하여 BODIPY는 조직 투과성이 더 강하고 LD와 더 잘 결합합니다12. BODIPY로 표지된 LD는 살아있는 세포를 염색하고 다른 세포 기관과 공동국소화하는 데 사용할 수 있다13.
지방간 질환의 발병률은 반추 동물에서 단위 동물보다 유의하게 높다14. 전환 기간 동안 젖소는 부정적인 에너지 균형 상태를 경험합니다3. 다량의 비에스테르화 지방산(팔미트산, 올레산, 리놀레산 등)이 소 간세포에서 TG로 합성되어 간 기능 이상을 유발하고 유제품의 품질과 생산 효율성을 크게 저하시킨다15. 본 연구는 LD의 크기와 수를 분석하고 LD 융합 역학을 모니터링하는 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 합니다. 우리는 간세포(16 )에 서로 다른 농도의 리놀레산(LA)을 첨가하여 LD 형성 모델을 구성하고, LD를 오일 레드 O로 염색하여 공정 중 LD의 크기와 수의 변화를 관찰했습니다. 또한, LD의 빠른 융합 과정은 BODIPY 493/503으로 염색하여 관찰되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
병리학 적 상태에 따라 간 LD는 크기와 수에 엄청난 변화를 겪습니다. LD는 간세포 세포에 널리 존재하며 간 건강과 질병에 중요한 역할을 한다18. LD의 양과 크기는 LD의 생물 발생에 대한 현재 연구의 기초입니다19. 세포와 조직의 LD의 크기와 수는 에너지를 저장하고 방출하는 능력을 반영합니다. LD의 동적 변화는 지질 대사 활동의 안정성을 유지합니다<sup class="x…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (U1904116)이 공동으로 지원했습니다.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
Referências
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