Bu protokol, lipit damlacıklarını (LD’ler) boyamak, yağ asidi kaynaklı yağlı hepatosit modelinde LD’lerin boyutunu ve sayısını hesaplamak ve canlı hücre görüntüleme ile küçük LD’lerin büyük LD’lere kaynaşma sürecini gözlemlemek için BODIPY 493/503’ün nasıl kullanılacağını açıklamaktadır.
Lipid damlacıkları (LD’ler), lipid metabolizmasında ve hücrelerde nötr lipid depolanmasında önemli rol oynayan organellerdir. Obezite, yağlı karaciğer hastalığı ve diyabet gibi çeşitli metabolik hastalıklarla ilişkilidirler. Hepatik hücrelerde, LD’lerin boyutları ve sayıları yağlı karaciğer hastalığının belirtileridir. Ayrıca, oksidatif stres reaksiyonu, hücre otofajisi ve apoptoza genellikle LD’lerin boyutlarında ve sayılarında değişiklikler eşlik eder. Sonuç olarak, LD’lerin boyutları ve miktarları, LD biyogenezinin mekanizması ile ilgili mevcut araştırmaların temelini oluşturmaktadır. Burada, yağ asidine bağlı sığır karaciğer hücrelerinde, LD’leri boyamak ve LD’lerin boyutlarını ve sayılarını araştırmak için yağ kırmızısı O’nun nasıl kullanılacağını açıklıyoruz. LD’lerin boyut dağılımı istatistiksel olarak analiz edilmiştir. Küçük LD’lerin büyük LD’lere kaynaşma süreci de canlı hücre görüntüleme sistemi tarafından gözlemlenir. Mevcut çalışma, farklı fizyolojik koşullar altında LD’lerin boyut değişim eğilimini doğrudan gözlemlemenin bir yolunu sunmaktadır.
Hepatositlerde lipid damlacığı (LD) birikimi, karaciğer fibrozisi ve hepatosellüler karsinoma ilerleyebilen alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının (NAFLD) tipik özelliğidir. Yağlı karaciğer hastalığının en erken belirtisinin, hepatosit1’in sitoplazmasında LD birikimi ile karakterize steatoz olduğu bulunmuştur. Karaciğer steatozu her zaman LDs2’nin artmış sayısı ve / veya genişlemiş boyutu ile ilişkilidir. LD’lerin, çekirdek olarak trigliseritten (TG) oluşan endoplazmik retikulumdan (ER) üretildiği ve proteinler ve fosfolipitlerle çevrili olduğu düşünülmektedir3. TG depolamasından sorumlu hücre altı organel olarak, LD’ler boyutları, sayıları, lipit kompozisyonları, proteinleri ve diğer organellerle etkileşimleri ile ilgili farklı özellikler sergilerler ve bunların hepsi hücre enerjisi homeostazını etkiler4. TG seviyesi LD’lerin boyutu ile pozitif ilişkilidir ve daha yüksek bir hücre içi TG içeriği daha büyük LD’leroluşturabilir 5. LD’ler, TG’nin lokal sentezi, ER’de lipit katılımı ve çoklu LD’lerin füzyonu yoluyla boyut olarak artar6. Büyük LD’ler içeren hücreler (adipositler, hepatositler, vb.), LD füzyonu ile lipit depolanmasını etkili bir şekilde arttırmak için özel bir mekanizmaya sahiptir. LD’lerin dinamik değişiklikleri, hücrenin farklı enerji metabolizması durumlarını yansıtır. Sağlıklı ve anormal hücrelerdeki çeşitli hepatik LD’lerin gözlemlenmesine ve analizine izin veren metodolojiler geliştirmek çok önemlidir.
LD’ler için ana floresan olmayan boyalar Sudan Siyah B ve yağ kırmızısı O. Sudan Siyah B nötr lipitleri, fosfolipitleri ve steroidleri boyar7. Yağ kırmızısı O esas olarak iskelet kası, kardiyomiyositler, karaciğer dokusu, yağ hücreleri, vb.LD’leri boyamak için kullanılır 8 ve farelerde ve insanlarda karaciğer steatozunun kantitatif tespiti için standart bir araç olarak kabul edilir9. LD’lerin dinamik değişimi esas olarak floresan boyama ile gerçekleştirilir. Nil kırmızısı ve BODIPY yaygın olarak kullanılan floresan lipit boyalarıdır10,11. Nil kırmızısı ile karşılaştırıldığında, BODIPY daha güçlü doku geçirgenliğine sahiptir ve LDs12 ile daha iyi bağlanır. BODIPY etiketli LD’ler, canlı hücreleri boyamak ve diğer organellerle kolokalizasyon için kullanılabilir13.
Ruminant hayvanlarda yağlı karaciğer hastalığı insidansı monogastrik hayvanlara göre anlamlı derecede yüksektir14. Geçiş döneminde, süt negatif enerji dengesi durumu yaşarlar3. Büyük miktarlarda esterleştirilmemiş yağ asitleri (palmitik asit, oleik asit, linoleik asit, vb.) sığır hepatositlerinde TG’lere sentezlenir, bu da karaciğer fonksiyonel anormalliğine yol açar ve süt ürünlerinin kalitesini ve üretim verimliliğini büyük ölçüde azaltır15. Bu çalışma, LD’lerin boyut ve sayılarını analiz etmek ve LD füzyon dinamiklerini izlemek için bir protokol sağlamayı amaçlamaktadır. Hepatositler16’ya farklı konsantrasyonlarda linoleik asit (LA) ekleyerek bir LD oluşum modeli oluşturduk ve LD’leri yağ kırmızısı O ile boyayarak işlem sırasında LD’lerin boyutundaki ve sayısındaki değişiklikleri gözlemledik. Ek olarak, LD’lerin hızlı füzyon süreci BODIPY 493/503 ile boyanarak da gözlenmiştir.
Patolojik durumlara bağlı olarak, hepatik LD’ler boyutlarında ve sayılarında muazzam değişikliklere uğrarlar. LD’ler hepatosit hücrelerinde yaygın olarak bulunur ve karaciğer sağlığı ve hastalığında önemli bir rol oynar18. LD’lerin miktarı ve büyüklüğü, LD’lerin biyogenezi üzerine yapılan güncel araştırmaların temelidir19. Hücreler ve dokular için LD’lerin büyüklüğü ve sayısı, enerji depolama ve serbest bırakma yeteneklerini yansıt?…
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (U1904116) tarafından ortaklaşa desteklenmiştir.
0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
cell counting chamber | equipment | ||
cell culture dish | Corning | 353002 | material |
cell sens software | Olympus IX73 | software | |
Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
Image view | image analysis sodtware | ||
linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
NIS-Elements | Nikon | software | |
oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
Pipette | Eppendorf | equipment | |
Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |