Valutazione della dimensione e della fusione delle goccioline lipidiche nelle cellule epatiche bovine
Summary
Il presente protocollo descrive come utilizzare l’olio rosso O per tingere le goccioline lipidiche (LD), calcolare la dimensione e il numero di LD in un modello di epatociti grassi indotto da acidi grassi e utilizzare BODIPY 493/503 per osservare il processo di piccole LD che si fondono in grandi LD mediante imaging di cellule vive.
Abstract
Le goccioline lipidiche (LD) sono organelli che svolgono un ruolo importante nel metabolismo dei lipidi e nella conservazione dei lipidi neutri nelle cellule. Sono associati a una varietà di malattie metaboliche, come l’obesità, la malattia del fegato grasso e il diabete. Nelle cellule epatiche, le dimensioni e il numero di LD sono segni di malattia del fegato grasso. Inoltre, la reazione allo stress ossidativo, l’autofagia cellulare e l’apoptosi sono spesso accompagnate da cambiamenti nelle dimensioni e nel numero di LD. Di conseguenza, le dimensioni e la quantità delle LD sono alla base della ricerca attuale sul meccanismo della biogenesi delle LD. Qui, nelle cellule epatiche bovine indotte da acidi grassi, descriviamo come utilizzare l’olio rosso O per colorare le LD e per studiare le dimensioni e il numero di LD. La distribuzione dimensionale delle LD viene analizzata statisticamente. Il processo di piccole LD che si fondono in grandi LD è anche osservato da un sistema di imaging di cellule vive. Il lavoro attuale fornisce un modo per osservare direttamente la tendenza al cambiamento delle dimensioni dei LD in diverse condizioni fisiologiche.
Introduction
L’accumulo di goccioline lipidiche (LD) negli epatociti è la caratteristica tipica della steatosi epatica non alcolica (NAFLD), che può progredire verso la fibrosi epatica e il carcinoma epatocellulare. È stato riscontrato che la prima manifestazione della malattia del fegato grasso è la steatosi, caratterizzata da accumulo di LD nel citoplasma dell’epatocita1. La steatosi epatica è invariabilmente associata ad un aumento del numero e/o ad una dimensione espansa delle LD2. Si ritiene che le LD siano generate dal reticolo endoplasmatico (ER), costituito da trigliceridi (TG) come nucleo, e sono circondate da proteine e fosfolipidi3. Come organello subcellulare responsabile della conservazione della TG, le LD mostrano caratteristiche diverse per quanto riguarda le loro dimensioni, numero, composizione lipidica, proteine e interazione con altri organelli, che influenzano l’omeostasi energetica cellulare4. Il livello di TG è positivamente correlato con le dimensioni delle LD e un contenuto di TG intracellulare più elevato potrebbe formare LD più grandi5. Le LD aumentano di dimensioni attraverso la sintesi locale di TG, l’incorporazione lipidica nell’ER e la fusione di più LD6. Le cellule (adipociti, epatociti, ecc.) che contengono grandi LD hanno un meccanismo speciale per aumentare efficacemente l’accumulo di lipidi mediante fusione LD. I cambiamenti dinamici delle LD riflettono i diversi stati del metabolismo energetico della cellula. È fondamentale sviluppare metodologie che permettano l’osservazione e l’analisi delle varie LD epatiche in cellule sane e anormali.
I principali coloranti non fluorescenti per LD sono Sudan Black B e rosso olio O. Sudan Black B colora lipidi neutri, fosfolipidi e steroidi7. L’olio rosso O viene utilizzato principalmente per la colorazione di LD di muscolo scheletrico, cardiomiociti, tessuto epatico, cellule adipose, ecc8., ed è considerato uno strumento standard per la rilevazione quantitativa della steatosi epatica nei topi e nell’uomo9. Il cambiamento dinamico delle LD è effettuato principalmente dalla tintura a fluorescenza. Il rosso del Nilo e il BODIPY sono entrambi coloranti lipidici fluorescenti comunemente usati10,11. Rispetto al rosso del Nilo, BODIPY ha una permeabilità tissutale più forte e si lega meglio con LDs12. I LD marcati con BODIPY possono essere utilizzati per la colorazione delle cellule viventi e la colocalizzazione con altri organelli13.
L’incidenza della steatosi epatica è significativamente più elevata nei ruminanti rispetto agli animali monogastrici14. Durante il periodo di transizione, le vacche da latte sperimentano uno stato di bilancio energetico negativo3. Grandi quantità di acidi grassi non esterificati (acido palmitico, acido oleico, acido linoleico, ecc.) sono sintetizzate in TG negli epatociti bovini, il che porta ad anomalie funzionali del fegato e riduce notevolmente la qualità dei prodotti lattiero-caseari e l’efficienza produttiva15. Il presente studio si propone di fornire un protocollo per analizzare la dimensione e il numero di LD, nonché per monitorare la dinamica di fusione LD. Abbiamo costruito un modello di formazione di LD aggiungendo diverse concentrazioni di acido linoleico (LA) negli epatociti16 e osservato i cambiamenti nelle dimensioni e nel numero di LD durante il processo colorando le LD con O rosso olio. Inoltre, il processo di rapida fusione delle LD è stato osservato anche mediante colorazione con BODIPY 493/503.
Protocol
Representative Results
Discussion
A seconda degli stati patologici, le LD epatiche subiscono enormi cambiamenti nelle loro dimensioni e numero. Le LD sono ampiamente presenti nelle cellule degli epatociti e svolgono un ruolo chiave nella salute e nella malattia del fegato18. La quantità e la dimensione delle LD sono alla base delle attuali ricerche sulla biogenesi delle LD19. La dimensione e il numero di LD per cellule e tessuti riflettono la loro capacità di immagazzinare e rilasciare energia. I cambiame…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta congiuntamente dalla National Natural Science Foundation of China (U1904116).
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
Referências
- Fujimoto, T., Parton, R. G. Not just fat: the structure and function of the lipid droplet. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838 (2011).
- Grasselli, E., et al. Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine. Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).
- Herdt, T. H. Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).
- Pino-de la Fuente, F., et al. Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism. Life Sciences. 298, 120522 (2022).
- O’Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells. Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).
- Gao, G., et al. Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).
- Tütüncü Konyar, S. Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum. Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).
- Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio. Micron. 39 (7), 819-824 (2008).
- Duan, X., et al. The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore. Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Raboisson, D., Mounié, M., Maigné, &. #. 2. 0. 1. ;. Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review. Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).
- Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. Associations of elevated nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States. Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).
- Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. Journal of Visualized Experiments. (171), e62543 (2021).
- Liu, L., et al. Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).
- Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Sanjabi, B., et al. Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes. Scientific Reports. 5, 8816 (2015).
- Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis. Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).
- Yang, A., Mottillo, E. P. Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics. Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).
- Sarnyai, F., et al. Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626 (2020).
- Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
- Fei, W., et al. A role for phosphatidic acid in the formation of "supersized" lipid droplets. PLoS Genetics. 7 (7), e1002201 (2011).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Wang, J., et al. Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecules. 23 (7), 1594 (2018).
