Sığır Hepatik Hücrelerinde Lipid Damlacık Büyüklüğü ve Füzyonunun Değerlendirilmesi
Summary
Bu protokol, lipit damlacıklarını (LD’ler) boyamak, yağ asidi kaynaklı yağlı hepatosit modelinde LD’lerin boyutunu ve sayısını hesaplamak ve canlı hücre görüntüleme ile küçük LD’lerin büyük LD’lere kaynaşma sürecini gözlemlemek için BODIPY 493/503’ün nasıl kullanılacağını açıklamaktadır.
Abstract
Lipid damlacıkları (LD’ler), lipid metabolizmasında ve hücrelerde nötr lipid depolanmasında önemli rol oynayan organellerdir. Obezite, yağlı karaciğer hastalığı ve diyabet gibi çeşitli metabolik hastalıklarla ilişkilidirler. Hepatik hücrelerde, LD’lerin boyutları ve sayıları yağlı karaciğer hastalığının belirtileridir. Ayrıca, oksidatif stres reaksiyonu, hücre otofajisi ve apoptoza genellikle LD’lerin boyutlarında ve sayılarında değişiklikler eşlik eder. Sonuç olarak, LD’lerin boyutları ve miktarları, LD biyogenezinin mekanizması ile ilgili mevcut araştırmaların temelini oluşturmaktadır. Burada, yağ asidine bağlı sığır karaciğer hücrelerinde, LD’leri boyamak ve LD’lerin boyutlarını ve sayılarını araştırmak için yağ kırmızısı O’nun nasıl kullanılacağını açıklıyoruz. LD’lerin boyut dağılımı istatistiksel olarak analiz edilmiştir. Küçük LD’lerin büyük LD’lere kaynaşma süreci de canlı hücre görüntüleme sistemi tarafından gözlemlenir. Mevcut çalışma, farklı fizyolojik koşullar altında LD’lerin boyut değişim eğilimini doğrudan gözlemlemenin bir yolunu sunmaktadır.
Introduction
Hepatositlerde lipid damlacığı (LD) birikimi, karaciğer fibrozisi ve hepatosellüler karsinoma ilerleyebilen alkolsüz yağlı karaciğer hastalığının (NAFLD) tipik özelliğidir. Yağlı karaciğer hastalığının en erken belirtisinin, hepatosit1’in sitoplazmasında LD birikimi ile karakterize steatoz olduğu bulunmuştur. Karaciğer steatozu her zaman LDs2’nin artmış sayısı ve / veya genişlemiş boyutu ile ilişkilidir. LD’lerin, çekirdek olarak trigliseritten (TG) oluşan endoplazmik retikulumdan (ER) üretildiği ve proteinler ve fosfolipitlerle çevrili olduğu düşünülmektedir3. TG depolamasından sorumlu hücre altı organel olarak, LD’ler boyutları, sayıları, lipit kompozisyonları, proteinleri ve diğer organellerle etkileşimleri ile ilgili farklı özellikler sergilerler ve bunların hepsi hücre enerjisi homeostazını etkiler4. TG seviyesi LD’lerin boyutu ile pozitif ilişkilidir ve daha yüksek bir hücre içi TG içeriği daha büyük LD’leroluşturabilir 5. LD’ler, TG’nin lokal sentezi, ER’de lipit katılımı ve çoklu LD’lerin füzyonu yoluyla boyut olarak artar6. Büyük LD’ler içeren hücreler (adipositler, hepatositler, vb.), LD füzyonu ile lipit depolanmasını etkili bir şekilde arttırmak için özel bir mekanizmaya sahiptir. LD’lerin dinamik değişiklikleri, hücrenin farklı enerji metabolizması durumlarını yansıtır. Sağlıklı ve anormal hücrelerdeki çeşitli hepatik LD’lerin gözlemlenmesine ve analizine izin veren metodolojiler geliştirmek çok önemlidir.
LD’ler için ana floresan olmayan boyalar Sudan Siyah B ve yağ kırmızısı O. Sudan Siyah B nötr lipitleri, fosfolipitleri ve steroidleri boyar7. Yağ kırmızısı O esas olarak iskelet kası, kardiyomiyositler, karaciğer dokusu, yağ hücreleri, vb.LD’leri boyamak için kullanılır 8 ve farelerde ve insanlarda karaciğer steatozunun kantitatif tespiti için standart bir araç olarak kabul edilir9. LD’lerin dinamik değişimi esas olarak floresan boyama ile gerçekleştirilir. Nil kırmızısı ve BODIPY yaygın olarak kullanılan floresan lipit boyalarıdır10,11. Nil kırmızısı ile karşılaştırıldığında, BODIPY daha güçlü doku geçirgenliğine sahiptir ve LDs12 ile daha iyi bağlanır. BODIPY etiketli LD’ler, canlı hücreleri boyamak ve diğer organellerle kolokalizasyon için kullanılabilir13.
Ruminant hayvanlarda yağlı karaciğer hastalığı insidansı monogastrik hayvanlara göre anlamlı derecede yüksektir14. Geçiş döneminde, süt negatif enerji dengesi durumu yaşarlar3. Büyük miktarlarda esterleştirilmemiş yağ asitleri (palmitik asit, oleik asit, linoleik asit, vb.) sığır hepatositlerinde TG’lere sentezlenir, bu da karaciğer fonksiyonel anormalliğine yol açar ve süt ürünlerinin kalitesini ve üretim verimliliğini büyük ölçüde azaltır15. Bu çalışma, LD’lerin boyut ve sayılarını analiz etmek ve LD füzyon dinamiklerini izlemek için bir protokol sağlamayı amaçlamaktadır. Hepatositler16’ya farklı konsantrasyonlarda linoleik asit (LA) ekleyerek bir LD oluşum modeli oluşturduk ve LD’leri yağ kırmızısı O ile boyayarak işlem sırasında LD’lerin boyutundaki ve sayısındaki değişiklikleri gözlemledik. Ek olarak, LD’lerin hızlı füzyon süreci BODIPY 493/503 ile boyanarak da gözlenmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Patolojik durumlara bağlı olarak, hepatik LD’ler boyutlarında ve sayılarında muazzam değişikliklere uğrarlar. LD’ler hepatosit hücrelerinde yaygın olarak bulunur ve karaciğer sağlığı ve hastalığında önemli bir rol oynar18. LD’lerin miktarı ve büyüklüğü, LD’lerin biyogenezi üzerine yapılan güncel araştırmaların temelidir19. Hücreler ve dokular için LD’lerin büyüklüğü ve sayısı, enerji depolama ve serbest bırakma yeteneklerini yansıt?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (U1904116) tarafından ortaklaşa desteklenmiştir.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200072 | reagent |
| 4% paraformaldehyde | Solarbio | P1110 | reagent |
| BODIPY 493/503 | invitrogen | 2295015 | reagent |
| Cedar oil | Solarbio | C7140 | reagent |
| cell counting chamber | equipment | ||
| cell culture dish | Corning | 353002 | material |
| cell sens software | Olympus IX73 | software | |
| Centrifuge | Eppendorf | equipment | |
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 2492319 | reagent |
| hematoxylin | DingGuo | AR0712 | reagent |
| Image view | image analysis sodtware | ||
| linoleic acid | Solarbio | SL8520 | reagent |
| Live Cell Station | Nikon A1 HD25 | equipment | |
| NIS-Elements | Nikon | software | |
| oil red O | Solarbio | G1260 | reagent |
| optical microscope | Olympus IX73 | equipment | |
| Penicillin & Streptomycin 100× | NCM Biotech | CLOOC5 | reagent |
| Phosphate Buffered Saline | HyClone | SH30258.01 | reagent |
| Pipette | Eppendorf | equipment | |
| Sealing agent | Solarbio | S2150 | reagent |
Referências
- Fujimoto, T., Parton, R. G. Not just fat: the structure and function of the lipid droplet. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (3), 004838 (2011).
- Grasselli, E., et al. Models of non-alcoholic fatty liver disease and potential translational value: The effects of 3,5-L-diiodothyronine. Annals of Hepatology. 16 (5), 707-719 (2017).
- Herdt, T. H. Ruminant adaptation to negative energy balance: Influences on the etiology of ketosis and fatty liver. Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 16 (2), 215-230 (2000).
- Pino-de la Fuente, F., et al. Exercise regulation of hepatic lipid droplet metabolism. Life Sciences. 298, 120522 (2022).
- O’Connor, D., Byrne, A., Berselli, G. B., Long, C., Keyes, T. E. Mega-stokes pyrene ceramide conjugates for STED imaging of lipid droplets in live cells. Analyst. 144 (5), 1608-1621 (2019).
- Gao, G., et al. Control of lipid droplet fusion and growth by CIDE family proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (10), 1197-1204 (2017).
- Tütüncü Konyar, S. Dynamic changes in insoluble polysaccharides and neutral lipids in the developing anthers of an endangered plant species, Pancratium maritimum. Plant Systematics and Evolution. 304, 397-414 (2018).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 598358 (2011).
- Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red O for analyzing the metabolic status in health and disease. Nature Protocols. 8 (6), 1149-1154 (2013).
- Diaz, G., Melis, M., Batetta, B., Angius, F., Falchi, A. M. Hydrophobic characterization of intracellular lipids in situ by Nile Red red/yellow emission ratio. Micron. 39 (7), 819-824 (2008).
- Duan, X., et al. The synthesis of polarity-sensitive fluorescent dyes based on the BODIPY chromophore. Dyes and Pigments. 89 (3), 217-222 (2011).
- Rumin, J., et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae. Biotechnology for Biofuels. 8, 42 (2015).
- Fam, T. K., Klymchenko, A. S., Collot, M. Recent advances in fluorescent probes for lipid droplets. Materials. 11 (9), 1768 (2018).
- Raboisson, D., Mounié, M., Maigné, &. #. 2. 0. 1. ;. Diseases, reproductive performance, and changes in milk production associated with subclinical ketosis in dairy cows: A meta-analysis and review. Journal of Dairy Science. 97 (12), 7547-7563 (2014).
- Ospina, P. A., Nydam, D. V., Stokol, T., Overton, T. R. Associations of elevated nonesterified fatty acids and β-hydroxybutyrate concentrations with early lactation reproductive performance and milk production in transition dairy cattle in the northeastern United States. Journal of Dairy Science. 93 (4), 1596-1603 (2010).
- Campos-Espinosa, A., Guzmán, C. A model of experimental steatosis in vitro: hepatocyte cell culture in lipid overload-conditioned medium. Journal of Visualized Experiments. (171), e62543 (2021).
- Liu, L., et al. Effects of nonesterified fatty acids on the synthesis and assembly of very low density lipoprotein in bovine hepatocytes in vitro. Journal of Dairy Science. 97 (3), 1328-1335 (2014).
- Wang, L., Liu, J. Y., Miao, Z. J., Pan, Q. W., Cao, W. L. Lipid droplets and their interactions with other organelles in liver diseases. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 133, 105937 (2021).
- Sanjabi, B., et al. Lipid droplets hypertrophy: a crucial determining factor in insulin regulation by adipocytes. Scientific Reports. 5, 8816 (2015).
- Saponaro, C., Gaggini, M., Carli, F., Gastaldelli, A. The subtle balance between lipolysis and lipogenesis: a critical point in metabolic homeostasis. Nutrients. 7 (11), 9453-9474 (2015).
- Yang, A., Mottillo, E. P. Adipocyte lipolysis: from molecular mechanisms of regulation to disease and therapeutics. Biochemical Journal. 477 (5), 985-1008 (2020).
- Gluchowski, N. L., Becuwe, M., Walther, T. C., Farese, R. V. Lipid droplets and liver disease: from basic biology to clinical implications. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (6), 343-355 (2017).
- Meex, R. C. R., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Modulation of myocellular fat stores: lipid droplet dynamics in health and disease. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 913-924 (2009).
- Sarnyai, F., et al. Effect of cis-and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2626 (2020).
- Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
- Fei, W., et al. A role for phosphatidic acid in the formation of "supersized" lipid droplets. PLoS Genetics. 7 (7), e1002201 (2011).
- Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells. Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).
- Wang, J., et al. Application of the fluorescent dye BODIPY in the study of lipid dynamics of the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecules. 23 (7), 1594 (2018).
