Desenvolvimento de um Sistema de Ensaio Alimentar para Avaliação do Efeito Inseticida de Fitoquímicos sobre Helicoverpa armigera
Summary
Este protocolo descreve o ensaio alimentar obrigatório para avaliar o efeito potencialmente tóxico de um fitoquímico sobre as larvas de insetos lepidópteros. Este é um bioensaio de insetos altamente escalável, fácil de otimizar a dose subletal e letal, atividade dissuasora e efeito fisiológico. Isso poderia ser usado para a triagem de inseticidas ecológicos.
Abstract
Helicoverpa armigera, um inseto lepidóptero, é uma praga polífaga com distribuição mundial. Este inseto herbívoro é uma ameaça às plantas e à produtividade agrícola. Em resposta, as plantas produzem vários fitoquímicos que impactam negativamente o crescimento e a sobrevivência do inseto. Este protocolo demonstra um método de ensaio alimentar obrigatório para avaliar o efeito de um fitoquímico (quercetina) sobre o crescimento, desenvolvimento e sobrevivência de insetos. Sob condições controladas, os neonatos foram mantidos até o segundo ínstar em dieta artificial pré-definida. Essas larvas de segundo ínstar foram autorizadas a se alimentar de uma dieta artificial controle e contendo quercetina por 10 dias. O peso corporal dos insetos, o estágio de desenvolvimento, o peso do frass e a mortalidade foram registrados em dias alternados. A mudança no peso corporal, a diferença no padrão alimentar e fenótipos de desenvolvimento foram avaliados ao longo do tempo de ensaio. O ensaio alimentar obrigatório descrito simula um modo natural de ingestão e pode ser escalado para um grande número de insetos. Permite analisar o efeito de fitoquímicos na dinâmica de crescimento, transição de desenvolvimento e aptidão geral de H. armigera. Além disso, esse arranjo também pode ser utilizado para avaliar alterações em parâmetros nutricionais e processos fisiológicos digestivos. Este artigo fornece uma metodologia detalhada para sistemas de ensaio de alimentação, que pode ter aplicações em estudos toxicológicos, triagem de moléculas inseticidas e compreensão de efeitos químicos em interações planta-inseto.
Introduction
Os fatores bióticos que afetam a produtividade das culturas são principalmente agentes patogênicos e pragas. Vários insetos-praga causam de 15% a 35% das perdas nas culturas agrícolas e afetam as práticas de sustentabilidade econômica1. Insetos pertencentes às ordens Coleoptera, Hemiptera e Lepidoptera são as principais ordens de pragas devastadoras. A natureza altamente adaptativa do ambiente tem beneficiado os lepidópteros na evolução de vários mecanismos de sobrevivência. Dentre os insetos lepidópteros, Helicoverpa armigera (Cotton bollworm) pode se alimentar de cerca de 180 culturas diferentes e causar danos significativos aos seus tecidos reprodutivos2. Em todo o mundo, a infestação por H. armigera resultou em uma perda de cerca de US$ 5 bilhões3. Algodão, grão-de-bico, feijão guandu, tomate, girassol e outras culturas são hospedeiros de H. armigera. Ele completa seu ciclo de vida em diferentes partes das plantas hospedeiras. Ovos postos por mariposas fêmeas eclodem nas folhas, seguindo-se de sua alimentação em tecidos vegetativos durante os estágios larvais. A fase larval é a mais destrutiva devido à sua natureza voraz e altamenteadaptável4,5. H. armigera apresenta distribuição global e invasão de novos territórios devido a seus atributos marcantes, como polifagia, excelentes habilidades migratórias, maior fecundidade, forte diapausa e surgimento de resistência às estratégias de controle de insetos existentes6.
Diversas moléculas químicas provenientes de terpenos, flavonoides, alcaloides, polifenóis, glicosídeos cianogênicos e muitos outros são amplamente utilizadas para o controle da infestação por H. armigera 7. No entanto, a aplicação frequente de moléculas químicas acarreta efeitos adversos ao meio ambiente e à saúde humana devido à aquisição de seus resíduos. Além disso, apresentam efeito prejudicial sobre vários predadores de pragas, resultando em desequilíbrio ecológico 8,9. Portanto, há necessidade de investigar opções seguras e ecologicamente corretas para moléculas químicas de controle de pragas.
Moléculas inseticidas naturais produzidas por plantas (fitoquímicos) podem ser usadas como uma alternativa promissora aos pesticidas químicos. Esses fitoquímicos incluem vários metabólitos secundários pertencentes às classes alcaloides, terpenóides e fenólicos 7,10. A quercetina é um dos flavonoides (compostos fenólicos) mais abundantes presentes em vários grãos, vegetais, frutas e folhas. Apresenta atividade dissuasora alimentar e inseticida contra insetos; Além disso, não é prejudicial aos inimigos naturais de pragas11,12. Assim, este protocolo demonstra o ensaio alimentar utilizando quercetina para avaliar seu efeito tóxico sobre H. armigera.
Vários métodos de bioensaio têm sido desenvolvidos para avaliar o efeito de moléculas naturais e sintéticas sobre a alimentação, crescimento, desenvolvimento e padrões comportamentais de um inseto13. Os métodos comumente utilizados incluem o ensaio de disco foliar, ensaio de escolha alimentar, ensaio de alimentação por gotículas, ensaio de contato, ensaio de cobertura de dieta e ensaio de alimentação obrigatória13,14. Esses métodos são classificados com base em como os pesticidas são aplicados aos insetos. O ensaio alimentar obrigatório é um dos métodos mais comumente utilizados, sensíveis, simples e adaptáveis para testar prováveis inseticidas e sua dose letal14. Em um ensaio de alimentação obrigatória, a molécula de interesse é misturada com uma dieta artificial. Isso proporciona consistência e controle sobre a composição da dieta, gerando resultados robustos e reprodutíveis. Variáveis importantes que afetam os ensaios alimentares são o estágio de desenvolvimento do inseto, a escolha do inseticida, fatores ambientais e tamanho da amostra. A duração do ensaio, o intervalo entre dois registros de dados, a frequência e a quantidade de dieta alimentada, a saúde dos insetos e a habilidade de manuseio dos operadores também podem influenciar o resultado dos ensaios alimentares 14,15.
Este estudo tem como objetivo demonstrar o ensaio de obrigatoriedade alimentar para avaliar o efeito da quercetina na sobrevivência e aptidão física de H. armigera . A avaliação de vários parâmetros, como peso corporal do inseto, taxa de mortalidade e defeitos de desenvolvimento, fornecerá informações sobre os efeitos inseticidas da quercetina. Enquanto isso, a mensuração de parâmetros nutricionais, incluindo a eficiência de conversão do alimento ingerido (ECI), eficiência de conversão do alimento digerido (ECD) e digestibilidade aproximada (AD), destacará os atributos antialimentares da quercetina.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bioensaios laboratoriais são úteis para prever desfechos e produzir dados comparativos de toxicidade de vários compostos em um curto período a um custo razoável. O bioensaio alimentar ajuda a interpretar as interações entre inseto-inseticida e inseto-planta-inseticida. É um método eficiente para medir a toxicidade de uma variedade de substâncias que simplifica significativamente o processo de estabelecimento da dose letal 50 (DL50), concentração letal 50 (CL50), ou qualquer outra concent…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SM, YP e VN reconhecem a bolsa concedida pela Comissão de Bolsas Universitárias, Governo da Índia, Nova Delhi. O RJ agradece ao Conselho de Pesquisa Científica e Industrial (CSIR), Índia, e ao CSIR-National Chemical Laboratory, Pune, Índia, pelo apoio financeiro sob os códigos de projeto MLP036626, MLP101526 e YSA000826.
Materials
| Agar Agar | Himedia | RM666 | Solidifying agent |
| Ascorbic acid | Himedia | CMS1014 | Vitamin C source |
| Bengal Gram | NA | NA | Protein and carbohydrate source |
| Casein | Sigma | C-5890 | Protein source |
| Cholesterol | Sisco Research Laboratories | 34811 | Fatty acid source |
| Choline Chloride | Himedia | GRM6824 | Ammonium salt |
| DMSO | Sigma | 67-68-5 | Solvent |
| GraphPad Prism v8.0 | https://www.graphpad.com/guides/prism/latest/user-guide/using_choosing_an_analysis.htm | ||
| Methyl Paraben | Himedia | GRM1291 | Antifungal agent |
| Multivitamin capsule | GalaxoSmithKline | NA | Vitamin source |
| Quercetin | Sigma | Q4951-10G | Phytochemical |
| Sorbic Acid | Himedia | M1880 | Antimicrobail agent |
| Streptomycin | Himedia | CMS220 | Antibiotic |
| Vitamin E capsule | Nukind Healthcare | NA | Vitamin E source |
| Yeast Extract | Himedia | RM027 | Amino acid source |
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