マウスにおける視運動性反射の視覚特徴選択性の定量化
Summary
ここでは、視運動性反射を定量化するための標準プロトコルについて説明します。仮想ドラム刺激とビデオ眼球撮影を組み合わせることで、行動の特徴選択性とその適応可塑性を正確に評価することができます。
Abstract
視運動性反射(OKR)は、視覚環境の全体的な動きによって引き起こされ、網膜画像を安定させるのに役立つ重要な先天的な眼球運動です。OKRは、その重要性と堅牢性から、視覚運動学習の研究や、遺伝的背景、年齢、薬物治療の異なるマウスの視覚機能の評価に使用されてきました。ここでは、頭部固定マウスのOKR応答を高精度に評価するための手順を紹介します。頭部固定は、前庭刺激が眼球運動に寄与することを除外することができ、視覚運動のみによって引き起こされる眼球運動を測定することが可能になります。OKRは、3台のコンピュータモニターに表示される垂直グレーティングが、水平方向に振動的に、または一方向に等速でドリフトする仮想ドラムシステムによって引き出されます。このバーチャルリアリティシステムにより、空間周波数、時間/振動周波数、コントラスト、輝度、回折格子の方向などの視覚パラメータを体系的に変更し、視覚特徴選択性のチューニング曲線を定量化することができます。高速赤外線ビデオ眼球撮影により、眼球運動の軌跡を正確に測定できます。個々のマウスの目は、年齢、性別、遺伝的背景の異なる動物間でOKRを比較する機会を提供するように調整されています。この手法の定量的な力により、この行動が加齢、感覚経験、または運動学習によって可塑的に適応するときの OKR の変化を検出できます。したがって、この手法は、眼の行動の可塑性を調査するために使用されるツールのレパートリーに貴重な追加になります。
Introduction
環境内の視覚刺激に反応して、私たちの目は、視線を移動したり、網膜画像を安定させたり、移動するターゲットを追跡したり、観察者から異なる距離にあるターゲットに2つの目の中心窩を合わせたりするために動きます1,2。動眼行動は、少なくとも部分的には眼球運動系が単純であることから、健康と疾患の神経回路を理解するための感覚運動統合の魅力的なモデルとして広く用いられてきた3。眼球は3対の外眼筋によって制御され、眼窩内で主に3つの対応する軸を中心に回転します:横軸に沿った挙上と下降、垂直軸に沿った内転と外転、前後軸に沿ったねじれと外転1,2。このようなシンプルなシステムにより、研究者は実験室環境でマウスの動眼行動を簡単かつ正確に評価することができます。
主な動眼運動行動の1つは、視運動性反射(OKR)です。この不随意眼球運動は、網膜上の画像のゆっくりとしたドリフトまたはスリップによって引き起こされ、動物の頭部またはその周囲が動くときに網膜画像を安定させるのに役立ちます2,4。行動パラダイムとしてのOKRは、いくつかの理由で研究者にとって興味深いものです。第一に、確実に刺激し、正確に定量することができる5,6。第二に、この行動を定量化する手順は比較的単純で標準化されており、動物の大規模なコホートの視覚機能を評価するために適用することができます7。第三に、この生得的な振る舞いは高度に可塑的である5,8,9。その振幅は、反復的な網膜スリップが長時間発生する場合5,8,9、または前庭入力2によって引き起こされる網膜画像を安定化する別のメカニズムである作業パートナーの前庭眼反射(VOR)が損なわれる場合に増強され得る5。OKR増強のこれらの実験パラダイムは、研究者が眼球運動学習の根底にある回路基盤を明らかにする力を与えます。
以前の研究では、主に 2 つの非侵襲的な方法が OKR の評価に使用されてきました: (1) ビデオ眼球撮影と物理ドラムの組み合わせ 7,10,11,12,13 または (2) 仮想ドラムと組み合わせたヘッドターンの任意の決定 6,14,15,16 .これらのアプリケーションは、眼球運動可塑性の分子および回路メカニズムを理解する上で実りある発見をもたらしましたが、これら2つの方法にはそれぞれいくつかの欠点があり、OKRの特性を定量的に調べる能力が制限されています。第一に、黒と白の縞模様やドットのパターンが印刷された物理的なドラムは、視覚パターンを簡単かつ迅速に変更することができず、空間周波数、方向、移動格子のコントラストなどの特定の視覚的特徴に対するOKRの依存性の測定を大きく制限します8,17。代わりに、これらの視覚的特徴に対する OKR の選択性のテストは、視覚的特徴を試行ごとに便利に変更できるコンピューター化された視覚刺激の恩恵を受けることができます。このようにして、研究者は多次元の視覚パラメータ空間でOKRの挙動を体系的に調べることができます。さらに、OKRアッセイの2番目の方法は、識別可能なOKRをトリガーする視覚パラメータの閾値のみを報告し、目または頭の動きの振幅は報告しません6,14,15,16。したがって、定量的検出力の欠如は、同調曲線の形状と好ましい視覚的特徴の分析、または正常状態と病理学的状態における個々のマウス間の微妙な違いの検出を妨げます。上記の制限を克服するために、ビデオ眼画像とコンピューター化された仮想視覚刺激を組み合わせて、最近の研究でOKRの行動をアッセイしました5,17,18,19,20。しかし、これらの以前に発表された研究は、十分な技術的詳細やステップバイステップの指示を提供しておらず、その結果、研究者が自分の研究のためにそのようなOKRテストを確立することは依然として困難です。
ここでは、ビデオ眼球撮影とコンピュータ化された仮想視覚刺激の組み合わせにより、明所視またはスコトープ条件下でのOKR行動の視覚特徴選択性を正確に定量化するプロトコルを提示します。マウスは、前庭刺激によって引き起こされる眼球運動を避けるために頭を固定します。高速度カメラを使用して、視覚パラメータを変化させた移動する格子を見ているマウスの眼球の動きを記録します。個々のマウスの眼球の物理的大きさは、眼球運動の角度を導出する精度を確保するために較正される21。この定量的手法により、年齢や遺伝的背景の異なる動物間でOKRの行動を比較したり、薬理学的治療や視覚運動学習によって引き起こされる変化をモニタリングしたりすることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで紹介するOKR行動アッセイの方法には、いくつかの利点があります。第一に、コンピュータで生成された視覚刺激は、物理的なドラムの本質的な問題を解決します。物理的なドラムが空間周波数、方向、またはコントラストチューニングの体系的な検査をサポートしていないという問題に対処するために8、仮想ドラムはこれらの視覚的パラメータを試行的に変更するこ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
方向調整のデータを共有してくれたYingtian Heに感謝します。この研究は、Canadian Foundation of Innovation and Ontario Research Fund (CFI/ORF project no. 37597)、NSERC (RGPIN-2019-06479)、CIHR (Project Grant 437007)、Connaught New Researcher Awardsからの助成金によって支援されました。
Materials
| 2D translational stage | Thorlabs | XYT1 | |
| Acrylic resin | Lang Dental | B1356 | For fixing headplate on skull and protecting skull |
| Bupivacaine | STERIMAX | ST-BX223 | Bupivacaine Injection BP 0.5%. Local anesthesia |
| Carprofen | RIMADYL | 8507-14-1 | Analgesia |
| Compressed air | Dust-Off | ||
| Eye ointment | Alcon | Systane | For maintaining moisture of eyes |
| Graphic card | NVIDIA | Geforce GTX 1650 or Quadro P620. | For generating single screen among three monitors |
| Heating pad | Kent Scientific | HTP-1500 | For maintaining body temperature |
| High-speed infrared (IR) camera | Teledyne Dalsa | G3-GM12-M0640 | For recording eye rotation |
| IR LED | Digikey | PDI-E803-ND | For CR reference and the illumination of the eye |
| IR mirror | Edmund optics | 64-471 | For reflecting image of eye |
| Isoflurane | FRESENIUS KABI | CP0406V2 | |
| Labview | National instruments | version 2014 | eye tracking |
| Lactated ringer | BAXTER | JB2324 | Water and energy supply |
| Lidocaine and epinephrine mix | Dentsply Sirona | 82215-1 | XYLOCAINE. Local anesthesia |
| Luminance Meter | Konica Minolta | LS-150 | for calibration of monitors |
| Matlab | MathWorks | version xxx | analysis of eye movements |
| Meyhoefer Curette | World Precision Instruments | 501773 | For scraping skull and removing fascia |
| Microscope calibration slide | Amscope | MR095 | to measure the magnification of video-oculography |
| Monitors | Acer | B247W | Visual stimulation |
| Neutral density filter | Lee filters | 299 | to generate scotopic visual stimulation |
| Nigh vision goggle | Alpha optics | AO-3277 | for scotopic OKR |
| Photodiode | Digikey | TSL254-R-LF-ND | to synchronize visual stimulation and video-oculography |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6503 | |
| Post | Thorlabs | TR1.5 | |
| Post holder | Thorlabs | PH1 | |
| PsychoPy | open source software | version xxx | visual stimulation toolkit |
| Scissor | RWD | S12003-09 | For skin removal |
| Superglue | Krazy Glue | Type: All purpose. For adhering headplate on the skull |
Referências
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