Nasonia vepseembryoer ble dissekert fra Lucillia sericata pupper etter parasitering i 12-24 timer og vasket med alkohol og 10% natriumhypoklorittoppløsning for å oppnå bakteriefrie embryoer. Etter å ha oppdrettet de bakteriefrie embryoene og forsynt dem med Nasonia oppdrettsmedium for å vokse og utvikle seg in vitro, ble bakteriefrie Nasonia voksne oppnådd.
Aseptisk oppdrettsteknologi er en metode for dyrking av insekter under sterile eller nesten sterile forhold, som effektivt kan eliminere påvirkning av eksterne mikroorganismer på insektmikrobiota og dermed fremme den raske utviklingen av insektmikrobiotaforskning. Nasonia (vepseslekt) er et parasittisk vepseinsekt som har mange fordeler, for eksempel kort levetid, høy genetisk variasjon, enkel betjening, etc., og er mye brukt som et insektmodellsystem. I motsetning til antibiotikabehandling, som bare kan redusere antall mikroorganismer hos dyr, kan aseptiske oppdrettsteknikker kontrollere både sammensetningen og mengden mikroorganismer hos dyr, noe som ytterligere letter studiet av vertsmikrobeinteraksjoner. Tidligere versjoner av Nasonia rearing medium (NRM) har imidlertid noen feil og problemer, for eksempel en kompleks og tidkrevende prepareringsprosess, enkel forurensning av bakterier eller sopp og kort lagringstid. Derfor løser denne studien disse problemene ved å optimalisere verktøyene som brukes i NRM-forberedelsesprosessen, lagringsforhold og komponentforhold. Det optimaliserte mediet kan tillate lagring ved -20 °C i minst 3 måneder og eliminere muligheten for NRM-forurensning under fôring av sterile veps. Dette forbedrer overlevelsen og helsenivået til aseptisk Nasonia ytterligere, noe som er viktig for å bruke Nasonia som modell for mikrobiell forskning.
Bakteriefrie dyr er dyr som ikke har påviselige levende mikroorganismer og parasitter1. Bakteriefrie embryoer kan fås ved å dissekere moren under aseptiske forhold og deretter heves i barrieresystemer2. Slike dyr kan brukes til å studere effekten av mikroorganismer på dyr, for eksempel på tarmmikrobiota, immunsystem og metabolisme1. Med visse tekniske midler kan mange insekter og til og med pattedyr gjøres sterile 3,4. Bakteriefrie dyr har en unik rolle og har vært mye brukt i ulike deler av mikrobiologisk forskning5. For eksempel har bruken av bakteriefrie Nasonia-veps avslørt at mikroorganismer kan hjelpe verter med å tilpasse seg nye miljøer under langvarig eksogent miljøstress 6,7.
Nasonia parasitoider er små parasittveps som injiserer eggene sine i puppene til fluer4. Det er fire kjente arter av Nasonia, inkludert Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti og Nasonia oneida8. N. vitripennis finnes over hele verden, mens de tre andre artene har begrenset utbredelse i Nord-Amerika4. Nasonia parasitoide veps regnes som ideelle modellinsekter på grunn av deres egenskaper, som lett dyrking, kort reproduksjonssyklus, sekvensert genom og langvarig diapause 8,9. De kan brukes til å studere ulike aspekter av insektevolusjon, genetikk, utvikling, atferd og symbiose10. Videre kan Nasonia parasitoid veps også bidra til å kontrollere skadelige fluer i landbruket og sykdom11. Den vellykkede etableringen av et sterilt insektsystem innebærer to hovedtrinn: (1) sterilisering av embryoene og (2) levering av steril mat til larver in vitro. For å få steril mat utviklet Brucker og Bordenstein 12 Nasonia oppdrettsmedium (NRMv1) i 2012 ved å bruke kjemikalier som antibiotika, blekemiddel og føtalt bovint serum for å drepe bakterier12. Den kjemiske steriliseringsmetoden resulterte imidlertid i lav overlevelse og eklosjonsrater av N. vitripennis13. Så, i 2016, utviklet Shropshire et al. NRMv2 ved å bruke en filtersteriliseringsmetode i stedet for en kjemisk steriliseringsmetode for å eliminere farene ved antibiotika og andre stoffer, og optimaliserte avlsprosessen13. Dessverre har denne metoden fortsatt noen ulemper, for eksempel utfordringene knyttet til å forberede og bruke mediet, samt risikoen for drukning, underernæring eller dehydrering for embryoer, larver og lukkede pupper14. Wang og Brucker14 forbedret nylig Nasonia rearing media versjon 3 (NRMv3) og bakteriefri oppdrett versjon 2 (GFRv2) protokoller. Disse forbedringene reduserte kostnadene og medieforbruket. NRMv3 har imidlertid svært kort lagringstid og er svært utsatt for forurensning.
Ved å bygge på NRMv3 ble lagringsmetoden og næringsstoffforholdet til NRM-forberedelsesverktøyet optimalisert i denne studien. Denne metodologiske forfiningen gjør det mulig å bruke N. vitripennis som en modell for mikrobiomstudier. Sammenlignet med NRMv3 utviklet av Wang et al.14, forbedrer det forbedrede verktøyet for klemming av Sarcophaga bullata pupa, en av NRM-råmaterialene, produksjonseffektiviteten til S. bullata pupa vevsvæske sammenlignet med 60 ml sprøyten med et bunnhull brukt av Wang et al.14. Vi justerte næringsforholdet mellom NRM, noe som førte til en viss økning i overlevelsesraten for bakteriefrie Nasonia-veps uten å påvirke utviklingstiden. I tillegg ble NRM pakket inn i sentrifugerør med liten kapasitet (1,5 ml) og frosset i et kjøleskap på -20 °C for å forlenge lagringstiden. Det er verdt å merke seg at mens vi brukte husfluen Lucilia sericata som vert og kilde for NRM-forberedelse, kan denne protokollen sannsynligvis tilpasses andre Nasonia-verter som er tilgjengelige i laboratoriet.
Ved bruk av høykapasitetsdeteksjonsteknologier som genomikk og metabolomikk har forskere gradvis innsett at det er stort genetisk mangfold og metabolsk kompleksitet i tarmmikrobiota16. Disse symbiotiske bakteriene er nært knyttet til ulike fysiologiske eller patologiske tilstander, for eksempel vertens ernæringsmessige metabolisme, svulster, immunitet og aldring gjennom komplekse interaksjoner med verten17. Imidlertid er forskningen knyttet til nettverket av sammensetnin…
The authors have nothing to disclose.
Finansiering: Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation of China (32270538), National Key R &D Program of China (2022YFF0710603), Natural Science Foundation of Beijing (6222046), og CAS strategiske finansiering via CAS-CSIRO finansieringsordningen (152111KYSB20210011) tildelt G.H.W. Forfatterbidrag: alle forfattere utviklet omfanget og fokuset for gjennomgangen og bidro til skrivingen av manuskriptet.
0.22 Sterile vacuum filter | NEST | 331011 | |
10% SodiumHypochlorite | LIRCON | XB-84BS-1 | |
1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
200 mesh nylon net | BIOBYING | BY-378Z | |
24 well-plate | NEST | 702001 | |
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters | Shanghai Xingya Purification Material Factory | HN-AA-JT-10079 | |
Absolute ethyl alcohol | Macklin | E809057-500ml | |
Cell Strainer | BIOLOGIX | 15-1100 | |
Commercial Drosophila Medium | Boer | B645446-500ml | |
Dissecting needle | Bioroyee | 17-9140 | |
Garlic press | Taobao | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
Lucillia sericata pupae | Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd. | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
Small writing brush | Cestidur | BL0508 | |
Stereoscope | SOPTOP | RX50 | |
Tweezers | SALMART | A109001-56 |