Nasonia-wespenembryo’s werden na parasitering gedurende 12-24 uur ontleed uit Lucillia sericata-poppen en gewassen met alcohol en 10% natriumhypochlorietoplossing om kiemvrije embryo’s te verkrijgen. Na het grootbrengen van de kiemvrije embryo’s en het leveren van Nasonia-opfokmedium om in vitro te groeien en zich te ontwikkelen, werden kiemvrije Nasonia-volwassenen verkregen.
Aseptische kweektechnologie is een methode om insecten te kweken onder steriele of bijna steriele omstandigheden, die de invloed van externe micro-organismen op insectenmicrobiota effectief kan elimineren en zo de snelle ontwikkeling van onderzoek naar insectenmicrobiota kan bevorderen. Nasonia (wespengeslacht) is een sluipwespinsect dat veel voordelen heeft, zoals een korte levensduur, hoge genetische variatie, eenvoudige bediening, enz., En wordt veel gebruikt als een insectenmodelsysteem. In tegenstelling tot antibioticabehandeling, die alleen het aantal micro-organismen bij dieren kan verminderen, kunnen aseptische opfoktechnieken zowel de samenstelling als de hoeveelheid micro-organismen bij dieren regelen, waardoor de studie van gastheer-microbe-interacties verder wordt vergemakkelijkt. Eerdere versies van Nasonia-opfokmedium (NRM) hebben echter enkele defecten en problemen, zoals een complex en tijdrovend bereidingsproces, eenvoudige besmetting door bacteriën of schimmels en een korte opslagtijd. Daarom lost deze studie deze problemen op door de tools te optimaliseren die worden gebruikt in het NRM-voorbereidingsproces, opslagomstandigheden en componentverhoudingen. Het geoptimaliseerde medium kan opslag bij -20 °C gedurende ten minste 3 maanden mogelijk maken en de mogelijkheid van NRM-besmetting tijdens het voeren van steriele wespen elimineren. Dit verbetert verder de overlevingskans en het gezondheidsniveau van aseptische Nasonia, wat belangrijk is voor het gebruik van Nasonia als model voor microbieel onderzoek.
Kiemvrije dieren zijn dieren die geen detecteerbare levende micro-organismen en parasieten hebben1. Kiemvrije embryo’s kunnen worden verkregen door de moeder onder aseptische omstandigheden te ontleden en vervolgens in barrièresystemenop te voeden 2. Dergelijke dieren kunnen worden gebruikt om de effecten van micro-organismen op dieren te bestuderen, zoals op de darmmicrobiota, het immuunsysteem en het metabolisme1. Met bepaalde technische middelen kunnen veel insecten en zelfs zoogdieren steriel worden gemaakt 3,4. Kiemvrije dieren hebben een unieke rol en zijn op grote schaal gebruikt in verschillende aspecten van microbiologisch onderzoek5. Het gebruik van kiemvrije Nasonia-wespen heeft bijvoorbeeld aangetoond dat micro-organismen gastheren kunnen helpen zich aan te passen aan nieuwe omgevingen onder langdurige exogene omgevingsstress 6,7.
Nasonia parasitoïden zijn kleine sluipwespen die hun eitjes injecteren in de poppen van vliegen4. Er zijn vier soorten Nasonia bekend, waaronder Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti pt Nasonia oneida8. N. vitripennis is wereldwijd te vinden, terwijl de andere drie soorten een beperkt bereik hebben in Noord-Amerika4. Nasonia sluipwespen worden beschouwd als ideale modelinsecten vanwege hun kenmerken, zoals gemakkelijke teelt, korte voortplantingscyclus, gesequenced genoom en lange termijn diapause 8,9. Ze kunnen worden gebruikt om verschillende aspecten van insectenevolutie, genetica, ontwikkeling, gedrag en symbiose te bestuderen10. Bovendien kunnen Nasonia-sluipwespen ook helpen bij het bestrijden van schadelijke vliegen in de landbouw en ziekten11. Het succesvol opzetten van een steriel insectensysteem omvat twee belangrijke stappen: (1) sterilisatie van de embryo’s en (2) levering van steriel voedsel aan de larven in vitro. Om steriel voedsel te verkrijgen, ontwikkelden Brucker en Bordenstein 12 in 2012 Nasonia-opfokmedium (NRMv1) door chemicaliën zoals antibiotica, bleekmiddel en foetaal runderserum te gebruiken om bacteriënte doden 12. De chemische sterilisatiemethode resulteerde echter in lage overlevings- en eclosiepercentages van N. vitripennis13. Vervolgens ontwikkelden Shropshire et al. in 2016 NRMv2 door een filtersterilisatiemethode te gebruiken in plaats van een chemische sterilisatiemethode om de gevaren van antibiotica en andere stoffen te elimineren en het fokproces te optimaliseren13. Helaas heeft deze methode nog steeds enkele nadelen, zoals de uitdagingen die gepaard gaan met het bereiden en gebruiken van het medium, evenals de risico’s van verdrinking, ondervoeding of uitdroging voor de embryo’s, larven en gesloten poppen14. Wang en Brucker14 hebben onlangs de Nasonia rearing media versie 3 (NRMv3) en de kiemvrije opfok versie 2 (GFRv2) protocollen verbeterd. Deze verbeteringen verminderden de kosten en het mediaverbruik. De NRMv3 heeft echter een zeer korte bewaartijd en is zeer gevoelig voor verontreiniging.
Voortbouwend op NRMv3 werden de opslagmethode van het NRM-voorbereidingsgereedschap en de nutriëntenverhouding in deze studie geoptimaliseerd. Deze methodologische verfijning vergemakkelijkt het gebruik van N. vitripennis als model voor microbioomstudies. Vergeleken met de NRMv3 ontwikkeld door Wang et al.14, verbetert het verbeterde hulpmiddel voor het knijpen van Sarcophaga bullata popa, een van de NRM-grondstoffen, de productie-efficiëntie van S. bullata-popweefselvloeistof aanzienlijk in vergelijking met de 60 ml spuit met een bodemgat die door Wang et al.14 wordt gebruikt. We pasten de voedingsstoffenverhouding van NRM aan, wat leidde tot een zekere toename van de overlevingskans van kiemvrije Nasonia-wespen zonder hun ontwikkelingstijd te beïnvloeden. Bovendien werd de NRM verpakt in centrifugebuizen met een kleine capaciteit (1,5 ml) en ingevroren in een koelkast van -20 °C om de opslagtijd te verlengen. Het is vermeldenswaard dat terwijl we de huisvlieg Lucilia sericata gebruikten als gastheer en bron voor NRM-voorbereiding, dit protocol waarschijnlijk kan worden aangepast voor andere Nasonia-gastheren die beschikbaar zijn in het laboratorium.
Met de toepassing van high-throughput detectietechnologieën zoals genomica en metabolomica, hebben onderzoekers zich geleidelijk gerealiseerd dat er een enorme genetische diversiteit en metabole complexiteit is in de darmmicrobiota16. Deze symbiotische bacteriën zijn nauw verwant aan verschillende fysiologische of pathologische toestanden, zoals het voedingsmetabolisme van de gastheer, tumoren, immuniteit en veroudering door complexe interacties met de gastheer17. Het ond…
The authors have nothing to disclose.
Financiering: dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation of China (32270538), het National Key R&D Program of China (2022YFF0710603), de Natural Science Foundation of Beijing (6222046) en de CAS strategische financiering via het CAS-CSIRO financieringsprogramma (152111KYSB20210011) toegekend aan G.H.W. Auteursbijdragen: alle auteurs ontwikkelden de reikwijdte en focus van de review en droegen bij aan het schrijven van het manuscript.
0.22 Sterile vacuum filter | NEST | 331011 | |
10% SodiumHypochlorite | LIRCON | XB-84BS-1 | |
1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
200 mesh nylon net | BIOBYING | BY-378Z | |
24 well-plate | NEST | 702001 | |
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters | Shanghai Xingya Purification Material Factory | HN-AA-JT-10079 | |
Absolute ethyl alcohol | Macklin | E809057-500ml | |
Cell Strainer | BIOLOGIX | 15-1100 | |
Commercial Drosophila Medium | Boer | B645446-500ml | |
Dissecting needle | Bioroyee | 17-9140 | |
Garlic press | Taobao | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
Lucillia sericata pupae | Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd. | No Catalog numbers | Purchase on Taobao |
Small writing brush | Cestidur | BL0508 | |
Stereoscope | SOPTOP | RX50 | |
Tweezers | SALMART | A109001-56 |