Optimalisering av oppdrettsprosedyren for bakteriefrie veps

Summary

Nasonia vepseembryoer ble dissekert fra Lucillia sericata pupper etter parasitering i 12-24 timer og vasket med alkohol og 10% natriumhypoklorittoppløsning for å oppnå bakteriefrie embryoer. Etter å ha oppdrettet de bakteriefrie embryoene og forsynt dem med Nasonia oppdrettsmedium for å vokse og utvikle seg in vitro, ble bakteriefrie Nasonia voksne oppnådd.

Abstract

Aseptisk oppdrettsteknologi er en metode for dyrking av insekter under sterile eller nesten sterile forhold, som effektivt kan eliminere påvirkning av eksterne mikroorganismer på insektmikrobiota og dermed fremme den raske utviklingen av insektmikrobiotaforskning. Nasonia (vepseslekt) er et parasittisk vepseinsekt som har mange fordeler, for eksempel kort levetid, høy genetisk variasjon, enkel betjening, etc., og er mye brukt som et insektmodellsystem. I motsetning til antibiotikabehandling, som bare kan redusere antall mikroorganismer hos dyr, kan aseptiske oppdrettsteknikker kontrollere både sammensetningen og mengden mikroorganismer hos dyr, noe som ytterligere letter studiet av vertsmikrobeinteraksjoner. Tidligere versjoner av Nasonia rearing medium (NRM) har imidlertid noen feil og problemer, for eksempel en kompleks og tidkrevende prepareringsprosess, enkel forurensning av bakterier eller sopp og kort lagringstid. Derfor løser denne studien disse problemene ved å optimalisere verktøyene som brukes i NRM-forberedelsesprosessen, lagringsforhold og komponentforhold. Det optimaliserte mediet kan tillate lagring ved -20 °C i minst 3 måneder og eliminere muligheten for NRM-forurensning under fôring av sterile veps. Dette forbedrer overlevelsen og helsenivået til aseptisk Nasonia ytterligere, noe som er viktig for å bruke Nasonia som modell for mikrobiell forskning.

Introduction

Bakteriefrie dyr er dyr som ikke har påviselige levende mikroorganismer og parasitter¹. Bakteriefrie embryoer kan fås ved å dissekere moren under aseptiske forhold og deretter heves i barrieresystemer². Slike dyr kan brukes til å studere effekten av mikroorganismer på dyr, for eksempel på tarmmikrobiota, immunsystem og metabolisme¹. Med visse tekniske midler kan mange insekter og til og med pattedyr gjøres sterile ^3,4. Bakteriefrie dyr har en unik rolle og har vært mye brukt i ulike deler av mikrobiologisk forskning⁵. For eksempel har bruken av bakteriefrie Nasonia-veps avslørt at mikroorganismer kan hjelpe verter med å tilpasse seg nye miljøer under langvarig eksogent miljøstress ^6,7.

Nasonia parasitoider er små parasittveps som injiserer eggene sine i puppene til fluer⁴. Det er fire kjente arter av Nasonia, inkludert Nasonia vitripennis, Nasonia longicornis, Nasonia giraulti og Nasonia oneida⁸. N. vitripennis finnes over hele verden, mens de tre andre artene har begrenset utbredelse i Nord-Amerika⁴. Nasonia parasitoide veps regnes som ideelle modellinsekter på grunn av deres egenskaper, som lett dyrking, kort reproduksjonssyklus, sekvensert genom og langvarig diapause ^8,9. De kan brukes til å studere ulike aspekter av insektevolusjon, genetikk, utvikling, atferd og symbiose¹⁰. Videre kan Nasonia parasitoid veps også bidra til å kontrollere skadelige fluer i landbruket og sykdom¹¹. Den vellykkede etableringen av et sterilt insektsystem innebærer to hovedtrinn: (1) sterilisering av embryoene og (2) levering av steril mat til larver in vitro. For å få steril mat utviklet Brucker og Bordenstein 12 Nasonia oppdrettsmedium (NRMv1) i 2012 ved å bruke kjemikalier som antibiotika, blekemiddel og føtalt bovint serum for å drepe bakterier¹². Den kjemiske steriliseringsmetoden resulterte imidlertid i lav overlevelse og eklosjonsrater av N. vitripennis¹³. Så, i 2016, utviklet Shropshire et al. NRMv2 ved å bruke en filtersteriliseringsmetode i stedet for en kjemisk steriliseringsmetode for å eliminere farene ved antibiotika og andre stoffer, og optimaliserte avlsprosessen¹³. Dessverre har denne metoden fortsatt noen ulemper, for eksempel utfordringene knyttet til å forberede og bruke mediet, samt risikoen for drukning, underernæring eller dehydrering for embryoer, larver og lukkede pupper¹⁴. Wang og Brucker¹⁴ forbedret nylig Nasonia rearing media versjon 3 (NRMv3) og bakteriefri oppdrett versjon 2 (GFRv2) protokoller. Disse forbedringene reduserte kostnadene og medieforbruket. NRMv3 har imidlertid svært kort lagringstid og er svært utsatt for forurensning.

Ved å bygge på NRMv3 ble lagringsmetoden og næringsstoffforholdet til NRM-forberedelsesverktøyet optimalisert i denne studien. Denne metodologiske forfiningen gjør det mulig å bruke N. vitripennis som en modell for mikrobiomstudier. Sammenlignet med NRMv3 utviklet av Wang et al.14, forbedrer det forbedrede verktøyet for klemming av Sarcophaga bullata pupa, en av NRM-råmaterialene, produksjonseffektiviteten til S. bullata pupa vevsvæske sammenlignet med 60 ml sprøyten med et bunnhull brukt av Wang et ^al.14. Vi justerte næringsforholdet mellom NRM, noe som førte til en viss økning i overlevelsesraten for bakteriefrie Nasonia-veps uten å påvirke utviklingstiden. I tillegg ble NRM pakket inn i sentrifugerør med liten kapasitet (1,5 ml) og frosset i et kjøleskap på -20 °C for å forlenge lagringstiden. Det er verdt å merke seg at mens vi brukte husfluen Lucilia sericata som vert og kilde for NRM-forberedelse, kan denne protokollen sannsynligvis tilpasses andre Nasonia-verter som er tilgjengelige i laboratoriet.

Protocol

1. Tilberedning av bakteriefritt Nasonia oppdrettsmedium Plasser de kommersielt tilgjengelige L. sericata-puppene (se materialfortegnelsen) på en overflate som har plass til alle puppene, for eksempel et brett eller et papirark. Kast eventuelle underutviklede larver, mørke gamle pupper, tomme puppeskjell, sagflis eller andre urenheter. Hold bare unge pupper som er brunrøde i fargen og overfør dem til et beger (ca. 3000-4000 pupper).ME…

Representative Results

Forberedelseseffektiviteten til NRM ble kraftig forbedret ved å forbedre prepareringsverktøyene. I tillegg ble problemet med NRM-forurensning i fôringsprosessen eliminert ved å optimalisere strategien og bevaringsmetoden. Samtidig hadde justert NRM et mer egnet næringsforhold for vekst og utvikling av bakteriefrie veps med L. sericata som vert. Overlevelsen av bakteriefrie veps fra larver til pupper var signifikant forbedret sammenlignet med bakteriefrie veps oppdrettet med NRMv3 ved bruk av GFRv2 (<strong …

Discussion

Ved bruk av høykapasitetsdeteksjonsteknologier som genomikk og metabolomikk har forskere gradvis innsett at det er stort genetisk mangfold og metabolsk kompleksitet i tarmmikrobiota¹⁶. Disse symbiotiske bakteriene er nært knyttet til ulike fysiologiske eller patologiske tilstander, for eksempel vertens ernæringsmessige metabolisme, svulster, immunitet og aldring gjennom komplekse interaksjoner med verten¹⁷. Imidlertid er forskningen knyttet til nettverket av sammensetnin…

Materials

0.22 Sterile vacuum filter	NEST	331011
10% SodiumHypochlorite	LIRCON	XB-84BS-1
1x PBS solution	Solarbio	P1020
200 mesh nylon net	BIOBYING	BY-378Z
24 well-plate	NEST	702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters	Shanghai Xingya Purification Material Factory	HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol	Macklin	E809057-500ml
Cell Strainer	BIOLOGIX	15-1100
Commercial Drosophila Medium	Boer	B645446-500ml
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Garlic press	Taobao	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Small writing brush	Cestidur	BL0508
Stereoscope	SOPTOP	RX50
Tweezers	SALMART	A109001-56