Набор скрининговых методик для быстрого обзора функции нейтрофилов

Summary

Этот протокол включает в себя набор функциональных анализов нейтрофилов, которые будут использоваться в качестве метода скрининга для охвата функций различных сигнальных путей. Протокол включает в себя первичную и простую оценку жизнеспособности, чистоты, продукции активных форм кислорода, миграцию в реальном времени, фагоцитоз и предварительное предложение внеклеточных ловушек нейтрофилов.

Abstract

Нейтрофилы известны как одна из первых линий защиты в врожденном иммунном ответе и могут выполнять многие специфические клеточные функции, такие как хемотаксис, обратная миграция, фагоцитоз, дегрануляция цитотоксических ферментов и метаболитов и высвобождение ДНК в виде внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ). Нейтрофилы не только жестко регулируют сигнализацию, но и участвуют в регуляции других компонентов иммунной системы. Поскольку свежие нейтрофилы терминально дифференцированы, недолговечны и сильно изменчивы у разных людей, важно максимально использовать собранные образцы. Исследователям часто необходимо проводить скрининговые анализы, чтобы оценить обзор многих функций нейтрофилов, на которые могут влиять конкретные оцениваемые условия. Для удовлетворения этой потребности был разработан набор тестов, следующих за единым процессом выделения нейтрофилов нормальной плотности, в поисках баланса между скоростью, полнотой, стоимостью и точностью. Полученные результаты могут быть использованы для обоснования и руководства последующими углубленными исследованиями. Эта процедура может быть проведена в среднем за 4 часа и включает в себя оценку жизнеспособности клеток, продукцию активных форм кислорода (АФК), миграцию в реальном времени и фагоцитоз дрожжей на предметных стеклах, оставляя достаточное количество клеток для более детальных подходов, таких как омиксные исследования. Кроме того, процедура включает в себя способ легко наблюдать предварительное предположение НВЛ после быстрого паноптического окрашивания, наблюдаемого с помощью световой микроскопии, при отсутствии специфических маркеров, хотя и достаточных, чтобы указать, стоит ли прилагать дальнейшие усилия в этом направлении. Разнообразие тестируемых функций объединяет общие моменты между тестами, сокращая время и затраты на анализ. Процедура получила название NeutroFun Screen, и хотя у нее есть ограничения, она уравновешивает вышеупомянутые факторы. Кроме того, целью этой работы является не определенный набор тестов, а скорее руководство, которое может быть легко адаптировано к ресурсам и потребностям каждой лаборатории.

Introduction

Нейтрофилы являются наиболее распространенными клетками врожденного иммунитета в крови человека и, как известно, играют важную роль в инфекции и воспалении, являясь первыми реагирующими на^{место повреждения тканей}. В последние годы растет признание решающей роли, которую нейтрофилы играют при различных заболеваниях и в поддержании гомеостаза². Нейтрофилы не только обладают жестко регулируемой сигнализацией, но и участвуют в регуляции других компонентов иммунной системы ^3,4,5. Таким образом, изучение нейтрофилов и их многочисленных необычных клеточных функций, таких как хемотаксис, обратная миграция⁶, фагоцитоз⁷, респираторный взрыв⁸ и высвобождение внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ)⁷, является обязательным в многочисленных исследовательских контекстах, где необходимо оценить потенциальные функциональные, морфологические или молекулярные изменения нейтрофилов, вызванные конкретными анализируемыми условиями.

Свежевыделенные нейтрофилы терминально дифференцированы, недолговечны, высокодинамичны и легко активируются⁹. Тем не менее, эффективный метод хранения, который не влияет на реакцию нейтрофилов, еще не достигнут, что затрудняет выполнение нескольких анализов, которые должны быть непрерывными. Кроме того, ранее описанные функциональные анализы^10,11, основанные на анализах, требующих цитометрии и/или флуоресцентного окрашивания, могут быть нежизнеспособным выбором, когда необходима широкая и первоначальная оценка нейтрофила.

Для решения этих проблем в данном протоколе описан набор тестов, которые могут быть проведены после одного процесса выделения, включая оценку жизнеспособности клеток, продукцию активных форм кислорода (АФК), миграцию в реальном времени и фагоцитоз Saccharomyces cerevisiae, результаты которых могут быть использованы для обоснования углубленных последующих исследований. Эта процедура, получившая название NeutroFun Screen, была разработана для того, чтобы охватить основные эффекторные активности, за исключением дегрануляции, и может быть завершена в среднем за 4 часа, включая 1 час активации. Кроме того, оставшиеся клетки могут быть использованы для более детальных подходов, таких как омиксные исследования. Преимущество этого метода заключается в его балансе между скоростью, комплексностью, стоимостью и точностью.

Кроме того, существует способ легко наблюдать за предварительным предложением НЭО, без конкретных маркеров, но достаточных для того, чтобы указать, стоит ли предпринимать дальнейшие усилия в этом направлении. Разнообразие тестируемых функций направлено на то, чтобы объединить общие моменты между тестами, сокращая время и затраты на анализ. Основная цель этого метода состоит в том, чтобы обеспечить сбалансированный, функциональный анализ скорости, полноты, стоимости и точности, который позволяет получить обзор реакции нейтрофилов, что делает его полезным начальным шагом в исследовании влияния новых стимулов на нейтрофилы нормальной плотности.

Protocol

Все эксперименты строго следовали этическим принципам, установленным институциональным наблюдательным советом Университета Бразилиа (процесс 13364819.0.0000.5558), а образцы были идентифицированы кодами для обеспечения анонимности доноров. Клетки были получены от нормальных здоровых доноро…

Representative Results

Метод изоляции по плотности, использованный в данном исследовании (рис. 1), соответствовал критериям предложенных экспериментов. Параметры нейтрофилов, полученные с помощью этого метода, включали жизнеспособность ≥98%, чистоту ≥94%) и выход клеток ≥1,5 x 107, при этом а?…

Discussion

Нейтрофилы являются очень динамичными и чувствительными клетками, которые недолговечны и еще не могут быть криоконсервированы, что затрудняет изучение их биологии. Поэтому необходимо соблюдать осторожные шаги для получения жизнеспособных, обогащенных и покоящихся нейт?…

Materials

CIM-Plate 16	Agilent	5665825001
CLARIOstar Plate Reader	BMG LABTECH		US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide	Dinâmica	1582
DNAse I	Sigma – Aldrich	DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma – Aldrich	E5134
Fast panoptic stain	Laborclin	620529
Glass slide	Exacta	7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red.	Sigma – Aldrich	55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate.	Sigma – Aldrich	H4641
Heparin	Blau	7896014655229
Laminar flow cabinet	Veco	VLFS-12
Microscope	Zeiss	415501-0101-002	Product details: Primostar 1
Mixing Block	BIOER	MB-102
Neubauer improved bright-lined	New Optik	1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine	Sigma – Aldrich	F3506
Nitroblue tetrazolium	Neon	CAS 298-83-9
Percoll	Cytiva	17089101	separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma – Aldrich	P8139
Phosphate buffered saline tablet	Sigma – Aldrich	P4417
ROTOFIX 32 A	Hettich	1206
Saccharomyces cerevisiae	Fleischmann
Safranin	Sigma – Aldrich	50240
Sodium dodecyl sulfate	Cytiva	17-1313-01
Sonicator	Qsonica	Q125
Trypan blue solution	Vetec	C.I. 23850
Vortex Genie 2	Scientific Industries, Inc.	0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose)	Agilent	380601050	Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software