Eine Reihe von Screening-Techniken für einen schnellen Überblick über die Funktion der Neutrophilen

Summary

Dieses Protokoll umfasst eine Reihe von funktionellen Neutrophilen-Assays, die als Screening-Methode verwendet werden, um Funktionen aus verschiedenen Signalwegen abzudecken. Das Protokoll beinhaltet eine erste und einfache Bewertung der Zelllebensfähigkeit, Reinheit, Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, Echtzeitmigration, Phagozytose und einen vorläufigen Vorschlag für neutrophile extrazelluläre Fallen.

Abstract

Neutrophile Granulozyten sind als eine der ersten Verteidigungslinien in der angeborenen Immunantwort bekannt und können viele bestimmte zelluläre Funktionen ausführen, wie z. B. Chemotaxis, Rückwanderung, Phagozytose, Degranulation von zytotoxischen Enzymen und Metaboliten und Freisetzung von DNA als neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs). Neutrophile Granulozyten haben nicht nur selbst eine streng regulierte Signalübertragung, sondern sind auch an der Regulation anderer Komponenten des Immunsystems beteiligt. Da frische Neutrophile unheilbar differenziert, kurzlebig und sehr variabel zwischen den Individuen sind, ist es wichtig, das Beste aus den gesammelten Proben zu machen. Forscher müssen häufig Screening-Assays durchführen, um einen Überblick über die vielen Funktionen von Neutrophilen zu erhalten, die von bestimmten zu untersuchenden Bedingungen beeinflusst werden können. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, wurde eine Reihe von Tests entwickelt, die einem einzigen Isolierungsprozess von Neutrophilen normaler Dichte folgen und ein Gleichgewicht zwischen Geschwindigkeit, Vollständigkeit, Kosten und Genauigkeit anstreben. Die Ergebnisse können als Begründung und Leitfaden für eingehende Folgestudien verwendet werden. Dieses Verfahren kann in einer durchschnittlichen Zeit von 4 Stunden durchgeführt werden und umfasst die Bewertung der Zelllebensfähigkeit, der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), der Echtzeitmigration und der Phagozytose von Hefe auf Glasobjektträgern, so dass genügend Zellen für detailliertere Ansätze wie Omics-Studien übrig bleiben. Darüber hinaus bietet das Verfahren eine Möglichkeit, nach einer schnellen panoptischen Färbung, die durch Lichtmikroskopie beobachtet wurde, auf einfache Weise eine vorläufige Vermutung von NETs zu beobachten, wobei es an spezifischen Markern mangelt, die jedoch ausreichen, um anzuzeigen, ob sich weitere Bemühungen auf diese Weise lohnen würden. Die Vielfalt der getesteten Funktionen kombiniert Gemeinsamkeiten zwischen den Tests und reduziert so den Zeit- und Kostenaufwand für die Analyse. Das Verfahren wurde NeutroFun Screen genannt, und obwohl es Einschränkungen hat, gleicht es die oben genannten Faktoren aus. Darüber hinaus ist das Ziel dieser Arbeit kein eindeutiges Testset, sondern vielmehr ein Leitfaden, der leicht an die Ressourcen und Anforderungen jedes Labors angepasst werden kann.

Introduction

Neutrophile Granulozyten sind die am häufigsten vorkommenden Zellen des angeborenen Immunsystems im menschlichen Blut und es ist bekannt, dass sie eine wichtige Rolle bei Infektionen und Entzündungen spielen, da sie die ersten Helfer sind, die an der Stelle der Gewebeschädigung eintreffen¹. In den letzten Jahren hat sich die Erkenntnis durchgesetzt, dass Neutrophile eine entscheidende Rolle bei einer Vielzahl von Krankheiten und bei der Unterstützung der Homöostase spielen². Neutrophile Granulozyten haben nicht nur selbst eine streng regulierte Signalübertragung, sondern sind auch an der Regulation anderer Komponenten des Immunsystems beteiligt ^3,4,5. Daher ist die Untersuchung von Neutrophilen und ihren vielen ungewöhnlichen zellulären Funktionen, wie Chemotaxis, Rückwanderung⁶, Phagozytose⁷, respiratorischer Ausbruch⁸ und die Freisetzung von neutrophilen extrazellulären Fallen (NETs⁾⁷, in zahlreichen Forschungskontexten unerlässlich, in denen es notwendig ist, die potenziellen funktionellen, morphologischen oder molekularen Veränderungen von Neutrophilen zu bewerten, die durch bestimmte zu analysierende Bedingungen ausgelöst werden.

Frisch isolierte Neutrophile sind terminal, kurzlebig, hochdynamisch und leicht zu aktivieren⁹. Eine effiziente Lagerungsmethode, die die Reaktionen der Neutrophilen nicht beeinflusst, wurde jedoch noch nicht erreicht, was es schwierig macht, mehrere Assays durchzuführen, die ununterbrochen sein müssen. Darüber hinaus sind zuvor beschriebene funktionelle Analysen^10,11, die auf Assays basieren, die Zytometrie und/oder Fluoreszenzfärbung erfordern, möglicherweise keine praktikable Wahl, wenn eine breite und erste Bewertung der Neutrophilen erforderlich ist.

Um diese Probleme anzugehen, beschreibt dieses Protokoll eine Reihe von Tests, die nach einem einzigen Isolierungsprozess durchgeführt werden können, einschließlich der Bewertung der Zelllebensfähigkeit, der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), der Echtzeitmigration und der Phagozytose von Saccharomyces cerevisiae, deren Ergebnisse zur Begründung eingehender Folgestudien verwendet werden können. Dieses Verfahren mit dem Namen NeutroFun Screen wurde entwickelt, um die wichtigsten Effektoraktivitäten mit Ausnahme der Degranulation zu umfassen, und kann in einer durchschnittlichen Zeit von 4 Stunden abgeschlossen werden, einschließlich 1 Stunde Aktivierung. Darüber hinaus können die verbleibenden Zellen für detailliertere Ansätze wie Omics-Studien verwendet werden. Der Vorteil dieser Methode liegt in der Balance zwischen Geschwindigkeit, Komplexität, Kosten und Genauigkeit.

Darüber hinaus gibt es eine Möglichkeit, einen vorläufigen Vorschlag von NETs leicht zu beobachten, ohne spezifische Marker, aber genug, um anzuzeigen, ob sich weitere Bemühungen in dieser Richtung lohnen würden. Die Vielfalt der getesteten Funktionen zielt darauf ab, Gemeinsamkeiten zwischen den Tests zu kombinieren und so den Zeit- und Kostenaufwand für die Analyse zu reduzieren. Das Hauptziel dieser Methode ist es, eine ausgewogene, funktionelle Analyse in Bezug auf Geschwindigkeit, Vollständigkeit, Kosten und Genauigkeit zu liefern, die einen Überblick über die Reaktion der Neutrophilen ermöglicht, was sie zu einem nützlichen ersten Schritt bei der Untersuchung der Auswirkungen neuer Stimuli auf Neutrophile normaler Dichte macht.

Protocol

Alle Experimente folgten strikt den ethischen Richtlinien, die vom institutionellen Prüfungsausschuss der Universität Brasilia festgelegt wurden (Prozess 13364819.0.0000.5558), und die Proben wurden durch Codes identifiziert, um die Anonymität der Spender zu gewährleisten. Die Zellen wurden von normalen, gesunden männlichen Spendern im Alter von 18 bis 35 Jahren gewonnen, die die Einverständniserklärung unterschrieben und die folgenden Zulassungskriterien erfüllten: Nichtraucher/Dampfer, keine chronischen Erkrank…

Representative Results

Die in dieser Studie verwendete dichtebasierte Isolationsmethode (Abbildung 1) erfüllte die Kriterien für die vorgeschlagenen Experimente. Zu den mit dieser Methode ermittelten neutrophilen Parametern gehörten die Lebensfähigkeit ≥98 %, die Reinheit ≥94 % und die Zellausbeute ≥1,5 x 107, wobei in den Screening-Tests keine Aktivierung nachweisbar war. Zwei relevante Schritte bei der Isolierung von PMNs sind die Antikoagulation und die Entfernung von Erythrozyten. Das Halt…

Discussion

Neutrophile Granulozyten sind hochdynamische und reaktionsfähige Zellen, die kurzlebig sind und noch nicht kryokonserviert werden können¹⁹, was die Untersuchung ihrer Biologie zu einer Herausforderung macht. Daher ist es wichtig, sorgfältige Schritte zu befolgen, um lebensfähige, angereicherte und ruhende Neutrophile zu erhalten^11,20. In dieser Studie wurde eine dichtebasierte Isolationstechnik verwendet, die den Schwerpunkt auf eine s…

Materials

CIM-Plate 16	Agilent	5665825001
CLARIOstar Plate Reader	BMG LABTECH		US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide	Dinâmica	1582
DNAse I	Sigma – Aldrich	DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate	Sigma – Aldrich	E5134
Fast panoptic stain	Laborclin	620529
Glass slide	Exacta	7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red.	Sigma – Aldrich	55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate.	Sigma – Aldrich	H4641
Heparin	Blau	7896014655229
Laminar flow cabinet	Veco	VLFS-12
Microscope	Zeiss	415501-0101-002	Product details: Primostar 1
Mixing Block	BIOER	MB-102
Neubauer improved bright-lined	New Optik	1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine	Sigma – Aldrich	F3506
Nitroblue tetrazolium	Neon	CAS 298-83-9
Percoll	Cytiva	17089101	separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma – Aldrich	P8139
Phosphate buffered saline tablet	Sigma – Aldrich	P4417
ROTOFIX 32 A	Hettich	1206
Saccharomyces cerevisiae	Fleischmann
Safranin	Sigma – Aldrich	50240
Sodium dodecyl sulfate	Cytiva	17-1313-01
Sonicator	Qsonica	Q125
Trypan blue solution	Vetec	C.I. 23850
Vortex Genie 2	Scientific Industries, Inc.	0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose)	Agilent	380601050	Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software