En uppsättning screeningtekniker för en snabb överblick över neutrofilfunktionen
Summary
Detta protokoll innehåller en uppsättning neutrofila funktionella analyser som ska användas som en screeningmetod för att täcka funktioner från olika signalvägar. Protokollet innehåller en inledande och enkel utvärdering av cellviabilitet, renhet, produktion av reaktiva syreradikaler, realtidsmigration, fagocytos och ett preliminärt förslag på neutrofila extracellulära fällor.
Abstract
Neutrofiler är kända som en av de första försvarslinjerna i det medfödda immunsvaret och kan utföra många speciella cellulära funktioner, såsom kemotaxi, omvänd migration, fagocytos, degranulering av cytotoxiska enzymer och metaboliter och frisättning av DNA som neutrofila extracellulära fällor (NET). Neutrofiler har inte bara en hårt reglerad signalering själva, utan deltar också i regleringen av andra komponenter i immunsystemet. Eftersom färska neutrofiler är terminalt differentierade, kortlivade och mycket varierande mellan individer är det viktigt att få ut det mesta av de insamlade proverna. Forskare behöver ofta utföra screeninganalyser för att bedöma en översikt över de många neutrofila funktioner som kan påverkas av specifika tillstånd som utvärderas. En uppsättning tester efter en enda isoleringsprocess av neutrofiler med normal densitet utvecklades för att tillgodose detta behov, och sökte en balans mellan hastighet, omfattning, kostnad och noggrannhet. Resultaten kan användas för att resonera och vägleda fördjupade uppföljningsstudier. Denna procedur kan utföras på en genomsnittlig tid av 4 timmar och inkluderar utvärdering av cellviabilitet, produktion av reaktiva syreradikaler (ROS), realtidsmigration och fagocytos av jäst på glasskivor, vilket lämnar tillräckligt med celler för mer detaljerade tillvägagångssätt som omics-studier. Dessutom innehåller proceduren ett sätt att enkelt observera ett preliminärt förslag på NET efter snabb panoptisk färgning observerad med ljusmikroskopi, med brist på specifika markörer, om än tillräckligt för att indikera om ytterligare ansträngningar på det sättet skulle vara värda besväret. Mångfalden av testade funktioner kombinerar gemensamma punkter bland testerna, vilket minskar analystiden och kostnaderna. Proceduren fick namnet NeutroFun Screen, och även om den har begränsningar, balanserar den de ovan nämnda faktorerna. Dessutom är syftet med detta arbete inte en definitiv testuppsättning, utan snarare en riktlinje som enkelt kan anpassas till varje labbs resurser och krav.
Introduction
Neutrofiler är de vanligaste medfödda immuncellerna i mänskligt blod och är kända för att spela en viktig roll i infektion och inflammation, eftersom de är de första som kommer till platsen för vävnadsskadan1. Under de senaste åren har det funnits ett växande erkännande av den avgörande roll som neutrofiler spelar i en mängd olika sjukdomar och för att stödja homeostas2. Neutrofiler har inte bara en hårt reglerad signalering själva, utan deltar också i regleringen av andra komponenter i immunsystemet 3,4,5. Därför är det absolut nödvändigt att undersöka neutrofiler och deras många ovanliga cellulära funktioner, såsom kemotaxis, omvänd migration6, fagocytos7, andningsutbrott8 och frisättning av neutrofila extracellulära fällor (NET)7, i många forskningssammanhang där det är nödvändigt att bedöma de potentiella neutrofila funktionella, morfologiska eller molekylära förändringar som utlöses av specifika förhållanden som analyseras.
Nyligen isolerade neutrofiler är terminalt differentierade, kortlivade, mycket dynamiska och lättaktiverade. En effektiv lagringsmetod som inte påverkar neutrofilsvaren har dock ännu inte uppnåtts, vilket gör det utmanande att utföra flera analyser som måste vara oavbrutna. Dessutom kan tidigare beskrivna funktionella analyser10,11, baserade på analyser som kräver cytometri och/eller fluorescerande färgning, inte vara ett genomförbart val när en bred och initial utvärdering av neutrofilen behövs.
För att ta itu med dessa problem beskriver detta protokoll en uppsättning tester som kan utföras efter en enda isoleringsprocess, inklusive utvärdering av cellviabilitet, produktion av reaktiva syreradikaler (ROS), realtidsmigration och fagocytos av Saccharomyces cerevisiae, vars resultat kan användas för att resonera om djupgående uppföljningsstudier. Denna procedur, som kallas NeutroFun Screen, utformades för att omfatta de ledande effektoraktiviteterna, förutom degranulering, och kan slutföras på en genomsnittlig tid av 4 timmar, inklusive 1 timmes aktivering. Dessutom kan de återstående cellerna användas för mer detaljerade metoder som omics-studier. Fördelen med denna metod ligger i dess balans mellan hastighet, omfattning, kostnad och noggrannhet.
Dessutom finns det ett sätt att enkelt observera ett preliminärt förslag på NET, utan specifika markörer, men tillräckligt för att indikera om ytterligare ansträngningar i den riktningen skulle vara värda besväret. Mångfalden av testade funktioner syftar till att kombinera gemensamma punkter mellan testerna, vilket minskar analystiden och kostnaderna. Huvudmålet med denna metod är att tillhandahålla en balanserad, funktionell analys avseende hastighet, omfattning, kostnad och noggrannhet som möjliggör en översikt över neutrofilens svar, vilket gör det till ett användbart första steg för att undersöka effekterna av nya stimuli på neutrofiler med normal densitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neutrofiler är mycket dynamiska och responsiva celler som är kortlivade och ännu inte kan kryokonserveras19, vilket gör undersökningar av deras biologi utmanande. Därför är det viktigt att följa noggranna steg för att få livskraftiga, berikade och vilande neutrofiler11,20. Denna studie använde en densitetsbaserad isoleringsteknik som betonar skonsam och minimal manipulation, samt användning av låga temperaturer fram till akti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna uppmärksammar följande finansiärer: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP och FINATEC.
Materials
| CIM-Plate 16 | Agilent | 5665825001 | |
| CLARIOstar Plate Reader | BMG LABTECH | US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software |
|
| Dimethyl sulfoxide | Dinâmica | 1582 | |
| DNAse I | Sigma – Aldrich | DN 25 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma – Aldrich | E5134 | |
| Fast panoptic stain | Laborclin | 620529 | |
| Glass slide | Exacta | 7102 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. | Sigma – Aldrich | 55037C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. | Sigma – Aldrich | H4641 | |
| Heparin | Blau | 7896014655229 | |
| Laminar flow cabinet | Veco | VLFS-12 | |
| Microscope | Zeiss | 415501-0101-002 | Product details: Primostar 1 |
| Mixing Block | BIOER | MB-102 | |
| Neubauer improved bright-lined | New Optik | 1110000 | |
| N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine | Sigma – Aldrich | F3506 | |
| Nitroblue tetrazolium | Neon | CAS 298-83-9 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | separation media |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma – Aldrich | P8139 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma – Aldrich | P4417 | |
| ROTOFIX 32 A | Hettich | 1206 | |
| Saccharomyces cerevisiae | Fleischmann | ||
| Safranin | Sigma – Aldrich | 50240 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Cytiva | 17-1313-01 | |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Trypan blue solution | Vetec | C.I. 23850 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | 0K-0500-902 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) | Agilent | 380601050 | Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software |
Referências
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020).
- Rosales, C., Lowell, C. A., Schnoor, M., Uribe-Querol, E. Neutrophils: their role in innate and adaptive immunity 2017. Journal of Immunology Research. 2017, 9748345 (2017).
- Castro, M., et al. Proteome analysis of resting human neutrophils. Protein & Peptide Letters. 13 (5), 481-487 (2006).
- Li, Y., et al. The regulatory roles of neutrophils in adaptive immunity. Cell Communication and Signaling. 17, 147 (2019).
- de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
- Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
- El-Benna, J., et al. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunological Reviews. 273 (1), 180-193 (2016).
- Castro, M. S., Cilli, E. M., Fontes, W. Combinatorial synthesis and directed evolution applied to the production of alpha-helix forming antimicrobial peptides analogues. Current Protein & Peptide Science. 7 (6), 473-478 (2006).
- Mihaila, A. C., et al. Transcriptional profiling and functional analysis of N1/N2 neutrophils reveal an immunomodulatory effect of S100A9-blockade on the pro-inflammatory N1 subpopulation. Frontiers in Immunology. 12, 708770 (2021).
- Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 7-23 (2015).
- Paulíková, E., Kociková, A., Sabol, M. Modification of a panoptic method of staining isolated cells. Bratislavske Lekarske Listy. 94 (12), 638-640 (1993).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-3 (2015).
- Libério, M. S., et al. Anti-proliferative and cytotoxic activity of pentadactylin isolated from Leptodactylus labyrinthicus on melanoma cells. Amino Acids. 40 (1), 51-59 (2011).
- Cano, P. M., Vargas, A., Lavoie, J. P. A real-time assay for neutrophil chemotaxis. BioTechniques. 60 (5), 245-251 (2016).
- Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-plate cell sensor arrays in the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. BioTechniques. 61 (3), 117-122 (2016).
- Björkstén, B., Nyström, K., Lindqvist, B. The nitroblue tetrazolium (NBT) test in endemic benign (epidemic) nephropathy. Acta Medica Scandinavica. 199 (1-6), 147-150 (1976).
- Aquino, E., et al. Proteomic analysis of neutrophil priming by PAF. Protein & Peptide Letters. 23 (2), 142-151 (2016).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
- Moghadam, Z. M., Henneke, P., Kolter, J. From flies to men: ROS and the NADPH oxidase in phagocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 628991 (2021).
- Pattan, S. S., Bhat, K. G., Pattar, G. D., Kuntagi, M. Comparison of three different techniques for isolation of neutrophils from blood and their utility in performing nitroblue tetrazolium test. International Journal of Basic and Applied Physiology. 8 (1), 41 (2019).
- Gooty, J. R., Shashirekha, A., Guntakala, V. R., Palaparthi, R. Estimation of phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in chronic and aggressive periodontitis patients with nitroblue tetrazolium test. Journal of Indian Society of Periodontology. 23 (4), 316 (2019).
- Langer, S., et al. Clinical and laboratory profiles of 17 cases of chronic granulomatous disease in north India. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 37 (1), 45-51 (2021).
- Oualha, R., et al. Infection of human neutrophils with Leishmania infantum or Leishmania major strains triggers activation and differential cytokines release. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 153 (2019).
- Zilinskas, J., Zekonis, J., Zekonis, G., Valantiejiene, A., Periokaite, R. The reduction of nitroblue tetrazolium by total blood in periodontitis patients and the aged. Stomatologijal. 9 (4), 105-108 (2007).
- Benov, L. Improved formazan dissolution for bacterial MTT assay. Microbiology Spectrum. 9 (3), e01637 (2021).
- Chen, Y., Junger, W. G. Measurement of oxidative burst in neutrophils. Methods in Molecular Biology. 844, 115-124 (2012).
- Richardson, M. P., Ayliffe, M. J., Helbert, M., Davies, E. G. A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods. 219 (1-2), 187-193 (1998).
- Jancinová, V., et al. The combined luminol/isoluminol chemiluminescence method for differentiating between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Report. 11 (3), 110-116 (2006).
- Nosál, R., et al. Pharmacological intervention with oxidative burst in human neutrophils. Interdisciplinary Toxicology. 10 (2), 56-60 (2017).
- Mol, S., et al. Efficient neutrophil activation requires two simultaneous activating stimuli. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10106 (2021).
- Schneider, L., et al. Flow cytometry evaluation of CD14/CD16 monocyte subpopulations in systemic sclerosis patients: a cross sectional controlled study. Advances in Rheumatology. 61 (1), 27 (2021).
- Akin, E., Pelen, N. N., Tiryaki, I. U., Yalcin, F. Parameter identification for gompertz and logistic dynamic equations. PLoS One. 15 (4), e0230582 (2020).
- Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (129), e56337 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- de Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865, 1621-1629 (2018).
- Masuda, S., et al. Measurement of NET formation in vitro and in vivo by flow cytometry. Cytometry Part A. 91 (8), 822-829 (2017).
- Zharkova, O., et al. A flow cytometry-based assay for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps in mixed cell populations. Cytometry Part A. 95 (3), 268-278 (2019).
- Hosseinnejad, A., et al. DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption. Biomaterials Science. 10 (1), 85-99 (2022).
- Chrysanthopoulou, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote differentiation and function of fibroblasts. The Journal of Pathology. 233 (3), 294-307 (2014).
- Tong, M., Abrahams, V. M. Visualization and quantification of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 2255, 87-95 (2021).
- Santana, C. J. C., et al. Biological properties of a novel multifunctional host defense peptide from the skin secretion of the chaco tree frog, boana raniceps. Biomolecules. 10 (5), 790 (2020).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
- Boero, E., et al. Use of flow cytometry to evaluate phagocytosis of staphylococcus aureus by human neutrophils. Frontiers in Immunology. 12, 635825 (2021).
- Karsten, C. B., et al. A versatile high-throughput assay to characterize antibody-mediated neutrophil phagocytosis. Journal of Immunological Methods. 471, 46-56 (2019).
- Smirnov, A., Solga, M. D., Lannigan, J., Criss, A. K. Using imaging flow cytometry to quantify neutrophil phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 2087, 127-140 (2020).
