Anrikning av mRNA og bisulfitt-mRNA-bibliotekforberedelse for neste generasjons sekvensering

Summary

Denne protokollen gir en enkel å følge arbeidsflyt for å gjennomføre poly (A) RNA-rensing, bisulfittkonvertering og bibliotekforberedelse ved hjelp av standardisert utstyr for en biologisk prøve av interesse.

Abstract

RNA posttranskripsjonelle modifikasjoner i forskjellige typer RNA-transkripsjoner er assosiert med mangfoldig RNA-regulering i eukaryote celler. Avvikende RNA 5-metylcytosinmodifikasjoner og det dysregulerte uttrykket av RNA-metyltransferaser har vist seg å være assosiert med forskjellige sykdommer, inkludert kreft. Transkriptombrede bisulfittsekvensering ble utviklet for å karakterisere posisjonene og de kvantitative cytosinmetyleringsnivåene i det bisulfittkonverterte RNA ved baseparoppløsningen. Her presenterer denne protokollen prosedyrene for to runder med poly (A) RNA-rensing, tre sykluser av bisulfittreaksjon og bibliotekforberedelse i detalj for å tillate transkriptomomfattende kartlegging av mRNA 5-metylcytosinmodifikasjonssteder. Vurderingen av RNA-kvantitet og kvalitet etter hovedreaksjonen er avgjørende for å overvåke RNA-integriteten og er et kritisk skritt for å sikre sekvenseringsbiblioteker av høy kvalitet. Ideelt sett kan prosedyrene fullføres innen tre dager. Med denne protokollen kan bruk av total RNA av høy kvalitet som inngang praktisk talt bygge opp robuste bisulfitt-mRNA-biblioteker for neste generasjons sekvensering fra prøven av interesse.

Introduction

Blant over 150 typer post-transkripsjonelle modifikasjoner¹, 5-metylcytosin (m⁵C) modifikasjon har blitt identifisert i ulike typer RNA, inkludert ribosomal RNA, overføring RNA, messenger RNA, mikro RNA, lang ikke-kodende RNA, vault RNA, enhancer RNA og små cajal kroppsspesifikke RNA². RNA m 5 C er assosiert med ulike biologiske og patologiske mekanismer som regulering av planterotutvikling³, viral genuttrykk⁴ og kreftprogresjon⁵. Målet med denne protokollen er å gi strømlinjeformede rørledninger for å karakterisere den transkriptombrede mRNA m⁵C modifikasjonsprofilen til biologiske prøver i forskjellige utviklingsstadier eller i sykdomsinnstillingen. Transkriptombrede bisulfittsekvensering ble utviklet for å karakterisere posisjonene og de kvantitative cytosinmetyleringsnivåene i det bisulfittkonverterte RNA ved baseparoppløsning 6,7,8,9. Dette er spesielt nyttig når man studerer sammenhengen mellom m⁵C og genuttrykk og RNA-skjebne som er involvert i de biologiske reguleringsmekanismene i celler. I pattedyrcellen er det to kjente m 5 C-lesere: ALYREF kan gjenkjenne m 5 C ved kjernen og fungerer som en mRNA-kjerne-til-cytosoltransportør¹⁰, mens YBX1 kan gjenkjenne m⁵C i cytoplasma og øke mRNA-stabilisering¹¹. Avvikende m⁵C mRNA relatert til immunveier ble rapportert i systemiske Lupus Erythematosus CD4+ T-celler¹². Studier har vist en sammenheng mellom mRNA m⁵C modifikasjon og modulering av kreftimmunitet og kreftprogresjon^13,14. Derfor kan kartlegging av m⁵C modifikasjonsprofilen på mRNA gi viktig informasjon for å belyse det potensielle regulatoriske maskineriet.

For å undersøke de funksjonelle rollene til RNA m 5 C modifikasjon under visse biologiske forhold, kan bisulfittkonverteringsbaserte (bsRNA-seq) og antistoffaffinitetsberikelsesbaserte tilnærminger somm 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq og 5-Aza-seq kombineres med høykapasitetssekvenseringsplattformen for å gi effektiv deteksjon av målrettede regioner og sekvenser med m⁵C-modifikasjonene på en transkriptom-bred skala^{15, 16}. Fordelen med denne protokollen gir det omfattende RNA m 5C landskapet ved en enkeltbaseoppløsning siden antistoffaffinitetsberikelsesbasert tilnærming er avhengig av tilgjengeligheten av antistoffer av høy kvalitet og kan oppnå enkeltfragmentoppløsningen av m⁵C metyleringslandskap¹⁷.

Alle RNA-prøver vil bli behandlet med to runder mRNA-anrikning ved bruk av oligo (dT) perler, tre sykluser med bisulfittreaksjon og sekvenseringsbibliotekets forberedelse. For å overvåke RNA-kvaliteten vil hver RNA-prøve bli undersøkt ved kapillær gelelektroforese før og etter prosedyrene for mRNA-rensing og bisulfittreaksjon for å vurdere fragmentfordeling. De rensede bibliotekene vil bli undersøkt av deres PCR-ampliconkvaliteter, DNA-størrelsesfordelingsfragmenter ved kapillær gelelektroforese, og deres samlede mengder undersøkt ved fluorescensfargestoffbaserte kvantitative analyser før sekvensering. Systemet kan også brukes til å analysere et bredt spekter av biologiske prøver som landbruksprodukter, isolerte virioner, cellelinjer, modellorganismer og patologiske prøver.

Protocol

1. Poly (A) RNA-rensing MERK: Bruk det totale RNA behandlet med DNase I og undersøk total RNA-kvalitet og integritet ved kapillær eller konvensjonell gelelektroforesevurdering før du går videre til poly (A) RNA-rensing. Etterforskere skal kunne identifisere 28S og 18S rRNA ribosomale bånd i høymolekylvektfeltet og 5.8S rRNA-båndet i lavmolekylvektfeltet uten signifikante smørebånd i elektrofherogrammet. Rensetrinnene følger i hovedsak produsentens instruksjoner med min…

Representative Results

En rekke bsRNA-seq-biblioteker fra cellelinje19 ble generert ved å følge prosedyrene i denne rapporten (figur 1). Etter total RNA-rensing ledsaget av DNase-behandling utført på cellelinjeprøver og kvalitetskontrollert ved gelelektroforese og UV-Vis-spektrofotometri (A260/A280), kan RNA-prøven gå videre til poly(A) RNA-anrikning. For å avgjøre om den doble rensingen kunne fjerne flertallet av ribosomalt RNA, ble renseeffektiviteten av poly (A)…

Discussion

I denne protokollen ble en detaljert rørledning av poly (A) anrikning, bisulfittkonvertering og bibliotekforberedelse oppnådd ved å benytte standardiserte komponenter. Videre sekvenseringsanalyse ga identifisering av mRNA 5-metylcytosin i prøver av interesse.

Det kritiske trinnet er kvaliteten på startmaterialet – totalt RNA – siden nedbrytningen av RNA vil påvirke utvinningsgraden av poly (A) RNA-rensing. Prøven bør håndteres nøye og RNase-forurensning unngås før poly (A) RNA-rens…

Materials

Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System	Agilent, Santa Clara, CA		RNA quality detection
AMpure XP beads	Beckman Coulter	A63881	purify DNA
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-4626	DNA quality dection
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit	Agilent, Santa Clara, CA	5067-1513	RNA quality dection
DiaMag02 – magnetic rack	Diagenode, Denville, NJ	B04000001	assist library preparation
DiaMag1.5 – magnetic rack	Diagenode, Denville, NJ	B04000003	assist poly(A) RNA purificaion
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	61011	poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2
Ethanol	J.T.Baker	64-17-5
EZ RNA methylation kit	Zymo, Irvine, CA	R5002	bisulfite treatment
Firefly luciferase mRNA	Promega, Madison, WI, USA	L4561	spike in control seqeunce
KAPA Library Quantification Kits	Roche, Switzerland	KK4824	library quantification
Nanodrop spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		Total RNA quantity detection
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1)	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7335S	library preparation
NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina	New England Biolabs, Ipswich, MA	E7760S	library preparation
Nuclease-free Water	Thermo Fisher Scientific	AM9932
P2 pipetman	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	4641010
Qubit 2.0 fluorometer	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA		RNA quantity detection
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32854	DNA quantity detection
Qubit RNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	Q32852	RNA quantity detection