העשרת ספריית mRNA וביסולפיט-mRNA הכנה לריצוף הדור הבא
Summary
פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה קלה למעקב לביצוע טיהור RNA פולי(A), המרת ביסולפיט והכנת ספרייה באמצעות ציוד סטנדרטי לדגימה ביולוגית מעניינת.
Abstract
שינויים לאחר שעתוק RNA בסוגים שונים של תעתיקי RNA קשורים לוויסות RNA מגוון בתאים איקריוטים. שינויים חריגים ב-RNA 5-methylcytosine והביטוי הלא מווסת של RNA methyltransferases הוכחו כקשורים למחלות שונות, כולל סרטן. ריצוף ביסולפיט רחב שעתוק פותח כדי לאפיין את המיקומים ואת רמות המתילציה הכמותית של ציטוזין ב-RNA המומר על ידי ביסולפיט ברזולוציית זוג הבסיס. בזאת, פרוטוקול זה מציג את ההליכים של שני סבבים של טיהור RNA פולי(A), שלושה מחזורים של תגובת ביסולפיט, והכנת ספרייה בפירוט כדי לאפשר מיפוי רחב שעתוק של אתרי שינוי mRNA 5-methylcytosine. הערכת כמות ואיכות ה-RNA לאחר התגובה העיקרית חיונית לניטור שלמות ה-RNA והיא צעד קריטי להבטחת ספריות ריצוף באיכות גבוהה. באופן אידיאלי, ניתן להשלים את ההליכים תוך שלושה ימים. באמצעות פרוטוקול זה, שימוש ב-RNA כולל באיכות גבוהה כקלט יכול למעשה לבנות ספריות ביסולפיט-mRNA חזקות לריצוף הדור הבא מהמדגם המעניין.
Introduction
בין למעלה מ-150 סוגים של שינויים שלאחר שעתוק1, זוהה שינוי 5-מתיל-ציטוזין (m5C) בסוגים שונים של RNA, כולל RNA ריבוזומלי, RNA העברה, רנ”א שליח, מיקרו-רנ”א, רנ”א ארוך שאינו מקודד, רנ”א קמרון, רנ”א משפר, ורנ”א קחאל קטן ספציפי לגוף2. הרנ”א m 5 C קשור למגוון מנגנונים ביולוגיים ופתולוגיים כגון ויסות התפתחות שורשי צמחים3, ביטוי גנים נגיפיים4 והתקדמות סרטן5. מטרת פרוטוקול זה היא לספק צינורות יעילים לאפיון פרופיל השינוי רחב התמלול mRNA m5C של דגימות ביולוגיות בשלבי התפתחות שונים או במסגרת המחלה. ריצוף ביסולפיט רחב שעתוק פותח כדי לאפיין את המיקומים ואת רמות המתילציה הכמותית של ציטוזין ב-RNA המומר על ידי ביסולפיט ברזולוציית זוג בסיס 6,7,8,9. זה שימושי במיוחד כאשר חוקרים את הקשר של m5C עם ביטוי גנים וגורל RNA המעורב במנגנוני הבקרה הביולוגיים בתאים. בתא היונקים ידועים שני קוראי m 5 C: ALYREF יכול לזהות m 5 C בגרעין ומשמש כטרנספורטר mRNA גרעין לציטוזול10, בעוד YBX1 יכול לזהות m5C בציטופלסמה ולהגביר את ייצובmRNA11. mRNA חריג m5C הקשור למסלולים חיסוניים דווח בתאי T אדמנתית אדמנתית CD4+12. מחקרים גילו קשר בין mRNA m5C שינוי ומודולציה של חסינות לסרטן והתקדמות סרטן13,14. לפיכך, מיפוי פרופיל השינוי m5C על mRNA יכול לספק מידע חיוני כדי להבהיר את מנגנון הרגולציה הפוטנציאלי.
כדי לחקור את התפקידים הפונקציונליים של שינויRNA m 5 C בתנאים ביולוגיים מסוימים, ניתן לשלב גישות מבוססות המרה ביסולפיט (bsRNA-seq) והעשרת זיקה לנוגדנים כגון m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq ו- 5-Aza-seq עם פלטפורמת הריצוף בתפוקה גבוהה כדי לספק זיהוי יעיל של אזורים ורצפים ממוקדים עם שינויי m5C בקנה מידה רחב של תעתיק15, 16. היתרון של פרוטוקול זה מספק את הנוף המקיף של RNAm 5 C ברזולוציה של בסיס יחיד, שכן הגישה מבוססת העשרת זיקה לנוגדנים מסתמכת על זמינותם של נוגדנים באיכות גבוהה ויכולה להשיג את הרזולוציה של מקטע יחיד של m5C methylation landscape17.
כל דגימות הרנ”א יעובדו בשני סבבים של העשרת mRNA באמצעות חרוזי אוליגו (dT), שלושה מחזורים של תגובת ביסולפיט והכנת ספריית הריצוף. כדי לפקח על איכות הרנ”א, כל דגימת RNA תיבדק על ידי אלקטרופורזה של ג’ל נימי לפני ואחרי הליכי טיהור mRNA ותגובה ביסולפיטית כדי להעריך את התפלגות המקטעים. הספריות המטוהרות ייבדקו על ידי תכונות אמפליקון ה-PCR שלהן, מקטעי פיזור גודל DNA על ידי אלקטרופורזה של ג’ל נימי, והכמויות הכוללות שלהן ייבדקו על ידי בדיקות כמותיות מבוססות צבעים פלואורסצנטיים לפני ריצוף. המערכת יכולה לשמש גם לניתוח ספקטרום רחב של דגימות ביולוגיות כגון תוצרת חקלאית, נגיפים מבודדים, קווי תאים, אורגניזמים לדוגמה ודגימות פתולוגיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול זה, צנרת מפורטת של העשרת פולי(A), המרת ביסולפיט והכנת ספרייה הושגה על ידי שימוש ברכיבים סטנדרטיים. ניתוח ריצוף נוסף סיפק זיהוי של mRNA 5-methylcytosine בדגימות מעניינות.
השלב הקריטי הוא איכות החומר ההתחלתי – סך כל הרנ”א – שכן פירוק הרנ”א ישפיע על קצב ההתאוששות של טיהור RNA פולי(A)….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה של טייוואן. [NSTC 111-2314-B-006-003]
Materials
| Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
| AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
| Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality dection |
| Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality dection |
| DiaMag02 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
| DiaMag1.5 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
| Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
| Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
| EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
| Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
| NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra  Directional RNA Library Prep Kit for Illumina |
New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
| Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |
Referências
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update. Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).
- Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease. Genes. 10 (2), 102 (2019).
- Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. RNA methylation in plants: An overview. Frontiers in Plant Science. 14, 1132959 (2023).
- Courtney, D. G., et al. Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression. Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).
- Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).
- Legrand, C., et al. Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs. Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).
- Schaefer, M. RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing. Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).
- Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).
- Schumann, U., et al. Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation. BMC Biology. 18 (1), 40 (2020).
- Yang, X., et al. 5-Methylcytosine promotes mRNA export – NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27, 606 (2017).
- Chen, X., et al. 5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).
- Guo, G., et al. Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430 (2020).
- Song, H., et al. Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy. Biomarker Research. 10 (1), 15 (2022).
- Xue, C., Zhao, Y., Li, L. Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer. Biomarker Research. 8 (1), 43 (2020).
- Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate. Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).
- Guo, G., et al. Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).
- Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231 (2020).
- Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current Protocols in Human Genetics. , (2009).
- Chen, S. -. Y., et al. RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer. Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).
- Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
- Han, X., et al. Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).
- Amort, T., et al. Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation. RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).
- Sun, Z., et al. Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells. Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).
- Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).
- Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit. Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).
- Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA. Scientific Reports. 9 (1), 12281 (2019).
- Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs. PLoS Genetics. 9 (5), e1003602 (2013).
- Furlan, M., et al. Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data. RNA Biology. 18, 31-40 (2021).
- Leger, A., et al. RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing. Nature Communications. 12 (1), 7198 (2021).
- Mateos, P. A., et al. Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing. bioRxiv. , (2022).
- Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis. NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045 (2022).
- Zhang, Z., et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).
- Chao, H. -. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
