该协议提供了一种易于遵循的工作流程,可使用标准化设备对感兴趣的生物样品进行poly(A)RNA纯化、亚硫酸氢盐转化和文库制备。
各种类型的 RNA 转录本中的 RNA 转录后修饰与真核细胞中的多种 RNA 调控有关。异常的 RNA 5-甲基胞嘧啶修饰和 RNA 甲基转移酶的失调表达已被证明与包括癌症在内的多种疾病有关。开发了全转录组亚硫酸氢盐测序,以表征亚硫酸氢盐转化的 RNA 在碱基对分辨率下的位置和定量胞嘧啶甲基化水平。在此,该协议详细介绍了两轮poly(A)RNA纯化,三个亚硫酸氢盐反应循环和文库制备的程序,以允许mRNA 5-甲基胞嘧啶修饰位点的转录组范围定位。主反应后RNA数量和质量的评估对于监测RNA完整性至关重要,也是确保高质量测序文库的关键步骤。理想情况下,这些程序可以在三天内完成。通过该方案,使用高质量的总RNA作为输入,实际上可以建立强大的亚硫酸氢盐-mRNA文库,用于从目标样品进行二代测序。
在 150 多种转录后修饰1 中,已在各种类型的 RNA 中鉴定出 5-甲基胞嘧啶 (m5C) 修饰,包括核糖体 RNA、转移 RNA、信使 RNA、micro RNA、长链非编码 RNA、vault RNA、增强子 RNA 和小 cajal 体特异性 RNA2。RNA m 5 C 与多种生物学和病理机制有关,例如调节植物根系发育3、病毒基因表达4 和癌症进展5。该协议的目的是提供简化的管道,以表征处于不同发育阶段或疾病环境中的生物样品的转录组范围的mRNA m5C修饰谱。开发了全转录组亚硫酸氢盐测序来表征亚硫酸氢盐转化 RNA 中碱基对分辨率为 6、7、8、9 的位置和定量胞嘧啶甲基化水平。这在研究 m5C 与参与细胞生物调控机制的基因表达和 RNA 命运的关联时特别有用。在哺乳动物细胞中,有两种已知的 m 5 C 读取器:ALYREF 可以识别细胞核的 m 5 C 并充当 mRNA 细胞核到胞质溶胶转运蛋白10,而 YBX1 可以识别细胞质中的 m5C 并增加 mRNA 稳定性11。系统性红斑狼疮 CD4+ T 细胞中报告了与免疫通路相关的异常 m5C mRNA12。研究表明,mRNA m5C 修饰与癌症免疫调节和癌症进展之间存在关联13,14。因此,在mRNA上绘制m5C修饰图谱可以为阐明潜在的调控机制提供关键信息。
为了研究RNA m 5 C修饰在某些生物学条件下的功能作用,基于亚硫酸氢盐转化(bsRNA-seq)和基于抗体亲和富集的方法,如m 5 C-RIP-seq、miCLIP-seq和5-Aza-seq,可以与高通量测序平台相结合,在转录组范围内使用m5C修饰对靶区和序列进行高效检测15,16.该协议的优势在于,由于基于抗体亲和富集的方法依赖于高质量抗体的可用性,因此该协议的优势在于单碱基分辨率下提供了全面的RNA m 5 C景观,并且可以实现m5C甲基化景观的单片段分辨率17。
所有 RNA 样品都将使用 oligo(dT) 微球进行两轮 mRNA 富集、三个亚硫酸氢盐反应循环和测序文库制备。为了监测 RNA 质量,将在 mRNA 纯化和亚硫酸氢盐反应程序前后通过毛细管凝胶电泳检查每个 RNA 样品,以评估片段分布。纯化的文库将通过其 PCR 扩增子质量进行检查,通过毛细管凝胶电泳检查 DNA 大小分布片段,并在测序前通过基于荧光染料的定量测定检查其总量。该系统还可用于分析广谱生物样品,如农产品、分离的病毒粒子、细胞系、模式生物和病理标本。
在该协议中,通过使用标准化组件实现了聚(A)富集,亚硫酸氢盐转化和文库制备的详细流程。进一步的测序分析提供了目标样品中mRNA 5-甲基胞嘧啶的鉴定。
关键步骤是起始材料(总RNA)的质量,因为RNA的降解会影响poly(A) RNA纯化的回收率。在进行poly(A) RNA纯化步骤之前,应小心处理样品并避免RNase污染。该过程的另一个关键部分是文库制备中的PCR循环次数。循环数的?…
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了台湾国家科学技术委员会的支持。[NSTC 111-2314-B-006-003]
Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality dection |
Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality dection |
DiaMag02 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
DiaMag1.5 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra Directional RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |