Berigelse af mRNA og bisulfit-mRNA biblioteksforberedelse til næste generations sekventering
Summary
Denne protokol giver en let at følge arbejdsgang til at udføre poly (A) RNA-oprensning, bisulfitkonvertering og biblioteksforberedelse ved hjælp af standardiseret udstyr til en biologisk prøve af interesse.
Abstract
RNA posttranskriptionelle modifikationer i forskellige typer RNA-transkripter er forbundet med forskellig RNA-regulering i eukaryote celler. Afvigende RNA-5-methylcytosinmodifikationer og den dysregulerede ekspression af RNA-methyltransferaser har vist sig at være forbundet med forskellige sygdomme, herunder kræftformer. Transkriptom-bred bisulfitsekventering blev udviklet til at karakterisere positionerne og de kvantitative cytosinmethyleringsniveauer i det bisulfitkonverterede RNA ved baseparopløsningen. Heri præsenterer denne protokol procedurerne for to runder af poly (A) RNA-oprensning, tre cyklusser af bisulfitreaktion og biblioteksforberedelse i detaljer for at muliggøre transkriptom-dækkende kortlægning af mRNA 5-methylcytosinmodifikationssteder. Vurderingen af RNA-mængde og kvalitet efter hovedreaktionen er afgørende for at overvåge RNA-integritet og er et kritisk skridt for at sikre sekventeringsbiblioteker af høj kvalitet. Ideelt set kan procedurerne afsluttes inden for tre dage. Med denne protokol kan brug af total RNA af høj kvalitet som input praktisk talt opbygge robuste bisulfit-mRNA-biblioteker til næste generations sekventering fra prøven af interesse.
Introduction
Blandt over 150 typer posttranskriptionelle modifikationer1 er 5-methylcytosin (m5C) modifikation blevet identificeret i forskellige typer RNA’er, herunder ribosomalt RNA, overførsels-RNA, messenger-RNA, mikro-RNA, langt ikke-kodende RNA, hvælvings-RNA, forstærker-RNA og små cajal-kropsspecifikke RNA’er2. RNA m 5 C er forbundet med forskellige biologiske og patologiske mekanismer såsom regulering af planterodsudvikling3, viral genekspression4 og kræftprogression5. Formålet med denne protokol er at tilvejebringe strømlinede rørledninger til karakterisering af den transkriptom-brede mRNA m5C modifikationsprofil af biologiske prøver i forskellige udviklingsstadier eller i sygdomsindstillingen. Transkriptom-dækkende bisulfitsekventering blev udviklet til at karakterisere positionerne og de kvantitative cytosinmethyleringsniveauer i det bisulfitkonverterede RNA ved baseparopløsning 6,7,8,9. Dette er især nyttigt, når man studerer sammenhængen mellem m5C og genekspression og RNA-skæbne, der er involveret i de biologiske reguleringsmekanismer i celler. I pattedyrcellen er der to kendte m 5 C-læsere: ALYREF kan genkende m 5 C ved kernen og fungerer som en mRNA-kerne-til-cytosoltransportør10, mens YBX1 kan genkende m5C i cytoplasmaet og øge mRNA-stabilisering11. Afvigende m5C mRNA’er relateret til immunveje blev rapporteret i systemiske lupus erythematosus CD4+ T-celler12. Undersøgelser har afsløret en sammenhæng mellem mRNA m5C modifikation og modulering af kræftimmunitet og kræftprogression13,14. Derfor kan kortlægning af m5C-modifikationsprofilen på mRNA’et give afgørende information til belysning af det potentielle reguleringsmaskineri.
For at undersøge de funktionelle roller af RNA m5 C-modifikation under visse biologiske betingelser kan de bisulfitkonverteringsbaserede (bsRNA-seq) og antistofaffinitetsberigelsesbaserede tilgange såsom m 5 C-RIP-seq, miCLIP-seq og 5-Aza-seq kombineres med high-throughput sekventeringsplatformen for at give effektiv detektion af målrettede regioner og sekvenser med m5C-modifikationerne på entranskriptom-bred skala15, 16. Fordelen ved denne protokol giver det omfattende RNA m 5C-landskab ved en enkeltbaseopløsning, da den antistofaffinitetsberigelsesbaserede tilgang er afhængig af tilgængeligheden af antistoffer af høj kvalitet og kunne opnå enkeltfragmentopløsningen af m5C methyleringslandskab17.
Alle RNA-prøver behandles med to runder mRNA-berigelse ved hjælp af oligo (dT) perler, tre cyklusser af bisulfitreaktion og sekventeringsbibliotekets forberedelse. For at overvåge RNA-kvaliteten undersøges hver RNA-prøve ved kapillærgelelektroforese før og efter procedurerne for mRNA-oprensning og bisulfitreaktion for at vurdere fragmentfordelingen. De oprensede biblioteker vil blive undersøgt ved deres PCR-amplikonkvaliteter, DNA-størrelsesfordelingsfragmenter ved kapillærgelelektroforese og deres samlede mængder undersøgt ved fluorescensfarvestofferbaserede kvantitative assays inden sekventering. Systemet kan også bruges til at analysere et bredt spektrum af biologiske prøver såsom landbrugsprodukter, isolerede virioner, cellelinjer, modelorganismer og patologiske prøver.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokol blev en detaljeret pipeline af poly (A) berigelse, bisulfitkonvertering og biblioteksforberedelse opnået ved at anvende standardiserede komponenter. Yderligere sekventeringsanalyse tilvejebragte identifikation af mRNA 5-methylcytosin i prøver af interesse.
Det kritiske trin er kvaliteten af udgangsmaterialet – total RNA – da nedbrydningen af RNA ville påvirke genvindingshastigheden for poly (A) RNA-oprensning. Prøven skal håndteres omhyggeligt, og RNase-kontaminering undg…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Science and Technology Council of Taiwan. [NSTC 111-2314-B-006-003]
Materials
| Agilent 2100 Electrophoresis Bioanalyzer System | Agilent, Santa Clara, CA | RNA quality detection | |
| AMpure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | purify DNA |
| Bioanalyzer DNA high sensitivity kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-4626 | DNA quality dection |
| Bioanalyzer RNA 6000 Pico kit | Agilent, Santa Clara, CA | 5067-1513 | RNA quality dection |
| DiaMag02 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000001 | assist library preparation |
| DiaMag1.5 – magnetic rack | Diagenode, Denville, NJ | B04000003 | assist poly(A) RNA purificaion |
| Dynabeads mRNA DIRECT purification kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 61011 | poly(A) RNA purificaion; Wash Buffer 1 and Wash Buffer 2 |
| Ethanol | J.T.Baker | 64-17-5 | |
| EZ RNA methylation kit | Zymo, Irvine, CA | R5002 | bisulfite treatment |
| Firefly luciferase mRNA | Promega, Madison, WI, USA | L4561 | spike in control seqeunce |
| KAPA Library Quantification Kits | Roche, Switzerland | KK4824 | library quantification |
| Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Total RNA quantity detection | |
| NEBNext multiplex Oligos for illumina (index Primer set1) | New England Biolabs, Ipswich, MA | E7335S | library preparation |
NEBNext Ultra  Directional RNA Library Prep Kit for Illumina |
New England Biolabs, Ipswich, MA | E7760S | library preparation |
| Nuclease-free Water | Thermo Fisher Scientific | AM9932 | |
| P2 pipetman | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4641010 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | RNA quantity detection | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32854 | DNA quantity detection |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | Q32852 | RNA quantity detection |
Referências
- Boccaletto, P., et al. MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2021 update. Nucleic Acids Research. 50, D231-D235 (2022).
- Bohnsack, K. E., Höbartner, C., Bohnsack, M. T. Eukaryotic 5-methylcytosine (m5C) RNA Methyltransferases: Mechanisms, Cellular Functions, and Links to Disease. Genes. 10 (2), 102 (2019).
- Shinde, H., Dudhate, A., Kadam, U. S., Hong, J. C. RNA methylation in plants: An overview. Frontiers in Plant Science. 14, 1132959 (2023).
- Courtney, D. G., et al. Epitranscriptomic addition of m5C to HIV-1 transcripts regulates viral gene expression. Cell Host & Microbe. 26 (2), 217-227 (2019).
- Jonkhout, N., et al. The RNA modification landscape in human disease. RNA. 23 (12), 1754-1769 (2017).
- Legrand, C., et al. Statistically robust methylation calling for whole-transcriptome bisulfite sequencing reveals distinct methylation patterns for mouse RNAs. Genome Research. 27 (9), 1589-1596 (2017).
- Schaefer, M. RNA 5-methylcytosine analysis by bisulfite sequencing. Methods in Enzymology. 560, 297-329 (2015).
- Amort, T., et al. Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biology. 18 (1), 1 (2017).
- Schumann, U., et al. Multiple links between 5-methylcytosine content of mRNA and translation. BMC Biology. 18 (1), 40 (2020).
- Yang, X., et al. 5-Methylcytosine promotes mRNA export – NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m5C reader. Cell Research. 27, 606 (2017).
- Chen, X., et al. 5-Methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nature Cell Biology. 21 (8), 978-990 (2019).
- Guo, G., et al. Disease activity-associated alteration of mRNA m(5) C methylation in CD4(+) T cells of systemic lupus erythematosus. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8 (5), 430 (2020).
- Song, H., et al. Biological roles of RNA m5C modification and its implications in cancer immunotherapy. Biomarker Research. 10 (1), 15 (2022).
- Xue, C., Zhao, Y., Li, L. Advances in RNA cytosine-5 methylation: detection, regulatory mechanisms, biological functions and links to cancer. Biomarker Research. 8 (1), 43 (2020).
- Helm, M., Motorin, Y. Detecting RNA modifications in the epitranscriptome: predict and validate. Nature Reviews Genetics. 18 (5), 275-291 (2017).
- Guo, G., et al. Advances in mRNA 5-methylcytosine modifications: Detection, effectors, biological functions, and clinical relevance. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 26, 575-593 (2021).
- Saplaoura, E., Perrera, V., Colot, V., Kragler, F. Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (159), e61231 (2020).
- Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current Protocols in Human Genetics. , (2009).
- Chen, S. -. Y., et al. RNA bisulfite sequencing reveals NSUN2-mediated suppression of epithelial differentiation in pancreatic cancer. Oncogene. 41 (22), 3162-3176 (2022).
- Squires, J. E., et al. Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA. Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).
- Han, X., et al. Dynamic DNA 5-hydroxylmethylcytosine and RNA 5-methycytosine reprogramming during early human development. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. , (2022).
- Amort, T., et al. Long non-coding RNAs as targets for cytosine methylation. RNA biology. 10 (6), 1003-1008 (2013).
- Sun, Z., et al. Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells. Epigenomics. 11 (4), 439-453 (2019).
- Huang, T., Chen, W., Liu, J., Gu, N., Zhang, R. Genome-wide identification of mRNA 5-methylcytosine in mammals. Nature Structural and Molecular Biology. 26 (5), 380-388 (2019).
- Rieder, D., Amort, T., Kugler, E., Lusser, A., Trajanoski, Z. meRanTK: methylated RNA analysis ToolKit. Bioinformatics. 32 (5), 782-785 (2015).
- Kraus, A. J., Brink, B. G., Siegel, T. N. Efficient and specific oligo-based depletion of rRNA. Scientific Reports. 9 (1), 12281 (2019).
- Edelheit, S., Schwartz, S., Mumbach, M. R., Wurtzel, O., Sorek, R. Transcriptome-wide mapping of 5-methylcytidine RNA modifications in bacteria, archaea, and yeast reveals m(5)C within archaeal mRNAs. PLoS Genetics. 9 (5), e1003602 (2013).
- Furlan, M., et al. Computational methods for RNA modification detection from nanopore direct RNA sequencing data. RNA Biology. 18, 31-40 (2021).
- Leger, A., et al. RNA modifications detection by comparative Nanopore direct RNA sequencing. Nature Communications. 12 (1), 7198 (2021).
- Mateos, P. A., et al. Identification of m6A and m5C RNA modifications at single-molecule resolution from Nanopore sequencing. bioRxiv. , (2022).
- Johnson, Z., Xu, X., Pacholec, C., Xie, H. Systematic evaluation of parameters in RNA bisulfite sequencing data generation and analysis. NAR Genomics and Bioinformatics. 4 (2), 045 (2022).
- Zhang, Z., et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nature Methods. 18 (10), 1213-1222 (2021).
- Chao, H. -. P., et al. Systematic evaluation of RNA-Seq preparation protocol performance. BMC Genomics. 20 (1), 571 (2019).
