Et normoterm ex vivo leverperfusion (NEVLP) system blev oprettet til muselever. Dette system kræver erfaring med mikrokirurgi, men giver mulighed for reproducerbare perfusionsresultater. Evnen til at udnytte muselever letter undersøgelsen af molekylære veje til at identificere nye perfusatadditiver og muliggør udførelse af eksperimenter med fokus på organreparation.
Denne protokol præsenterer et optimeret erythrocytfrit NEVLP-system ved hjælp af muselever. Ex vivo-konservering af muselever blev opnået ved at anvende modificerede kanyler og teknikker tilpasset fra konventionelt kommercielt ex vivo-perfusionsudstyr. Systemet blev brugt til at evaluere bevaringsresultaterne efter 12 timers perfusion. C57BL/6J-mus fungerede som leverdonorer, og leveren blev plantet ved at kanylere portalvenen (PV) og galdegangen (BD) og efterfølgende skylle organet med varmt (37 °C) hepariniseret saltvand. Derefter blev de udplantede lever overført til perfusionskammeret og udsat for normoterm oxygeneret maskinperfusion (NEVLP). Indløbs- og udløbsperfusatprøver blev indsamlet med 3 timers mellemrum til perfusatanalyse. Efter afslutning af perfusionen blev leverprøver opnået til histologisk analyse med morfologisk integritet vurderet under anvendelse af modificeret Suzuki-score gennem hæmatoxylin-Eosin (HE) farvning. Optimeringseksperimenterne gav følgende resultater: (1) mus, der vejer over 30 g, blev anset for mere egnede til eksperimentet på grund af den større størrelse af deres galdegang (BD). (2) en 2 Fr (udvendig diameter = 0,66 mm) polyurethankanyle var bedre egnet til kanylering af portalvenen (PV) sammenlignet med en polypropylenkanyle. Dette blev tilskrevet polyurethanmaterialets forbedrede greb, hvilket resulterede i reduceret kateterglidning under overførslen fra kroppen til orgelkammeret. (3) til kanylering af galdegangen (BD) blev en 1 Fr (udvendig diameter = 0,33 mm) polyurethankanyle fundet mere effektiv sammenlignet med polypropylen UT – 03 (ydre diameter = 0,30 mm) kanyle. Med denne optimerede protokol blev muselever med succes bevaret i en varighed på 12 timer uden væsentlig indvirkning på den histologiske struktur. Hematoxylin-Eosin (HE) farvning afslørede en velbevaret morfologisk arkitektur i leveren, kendetegnet ved overvejende levedygtige hepatocytter med tydeligt synlige kerner og mild udvidelse af hepatiske sinusoider.
Levertransplantation repræsenterer guldstandardbehandlingen for personer med leversygdom i slutstadiet. Desværre overstiger efterspørgslen efter donororganer det tilgængelige udbud, hvilket fører til en betydelig mangel. I 2021 var ca. 24.936 patienter på venteliste til et levertransplantat, mens kun 9.234 transplantationer blev udført med succes1. Den betydelige forskel mellem udbud og efterspørgsel efter levertransplantater understreger det presserende behov for at undersøge alternative strategier for at udvide donorpuljen og forbedre tilgængeligheden af levertransplantater. En måde at udvide donorpuljen på er at bruge marginale donorer2. Marginale donorer omfatter dem med fremskreden alder, moderat eller svær steatose. Selvom transplantation af marginale organer kan give gunstige resultater, forbliver de samlede resultater suboptimale. Som følge heraf er udviklingen af terapeutiske strategier, der tager sigte på at forbedre marginaldonorernes funktion, i øjeblikket i gang 3,4.
En af strategierne er at bruge maskinperfusion, især normoterm oxygeneret maskinperfusion, for at forbedre funktionen af disse marginale organer5. Der er dog stadig en begrænset forståelse af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for de gavnlige virkninger af normoterm oxygeneret maskinperfusion (NEVLP). Mus, med deres rigelige tilgængelighed af genetisk modificerede stammer, tjener som værdifulde modeller til undersøgelse af molekylære veje. For eksempel er betydningen af autofagiveje til at afbøde leveriskæmi-reperfusionsskade i stigende grad blevet anerkendt 6,7. En vigtig molekylær vej i leveriskæmi-reperfusionsskaden er miR-20b-5p / ATG7-vejen8. I øjeblikket er der en række ATG-knockout- og betingede knock-out-musestammer tilgængelige, men ingen tilsvarende rottestammer9.
Baseret på denne baggrund var målet at generere en miniaturiseret NEVLP-platform til muselevertransplantater. Denne platform vil lette udforskningen og evalueringen af potentielle genetisk modificerede strategier, der har til formål at forbedre donorleverens funktionalitet. Derudover var det vigtigt, at systemet var egnet til langvarig perfusion, hvilket muliggør ex vivo-behandling af leveren, almindeligvis omtalt som “organreparation”.
I betragtning af den begrænsede tilgængelighed af relevante in vitro-data om perfusion af muselever fokuserede litteraturgennemgangen på studier udført på rotter. En systematisk litteratursøgning fra 2010 til 2022 blev udført ved hjælp af nøgleord som “normoterm leverperfusion”, “ex vivo eller in vitro” og “rotter“. Denne søgning havde til formål at identificere optimale forhold hos gnavere, så vi kunne bestemme den mest hensigtsmæssige tilgang.
Perfusionssystemet består af et forseglet vandkappet glasbufferreservoir, en peristaltisk rullepumpe, en oxygenator, en boblefælde, en varmeveksler, et orgelkammer og et lukket cykelslangesystem (figur 1). Systemet sikrer præcis vedligeholdelse af en konstant perfusionstemperatur på 37 °C ved hjælp af en dedikeret termostatisk maskine. Den peristaltiske rullepumpe driver strømmen af perfusat gennem kredsløbet. Perfusionskredsløbet starter ved det isolerede vandkappede reservoir. Derefter ledes perfusatet gennem oxygenatoren, som modtager en gasblanding af 95% ilt og 5% kuldioxid fra en dedikeret gasflaske. Efter iltning passerer perfusatet gennem boblefælden, hvor eventuelle indesluttede bobler omdirigeres tilbage til reservoiret af den peristaltiske pumpe. Det resterende perfusat strømmer gennem varmeveksleren og kommer ind i orgelkammeret, hvorfra det vender tilbage til reservoiret.
Her rapporterer vi vores erfaringer med at etablere en NEVLP til muselever og deler de lovende resultater af et piloteksperiment udført ved hjælp af det iltede medium uden iltbærere.
Kritiske trin i protokollen
De to afgørende trin i levereksplantation er kanylering af portalvenen (PV) og den efterfølgende kanylering af galdegangen (BD). Disse trin er af afgørende betydning for at sikre vellykket organudtagning og efterfølgende perfusions- eller transplantationsprocedurer.
Udfordringer og løsninger
PV-kanylering giver tre udfordringer: skade på beholdervæggen, forskydning af kateteret og praktisk anvendelighed af indsættelses…
The authors have nothing to disclose.
Under hele udarbejdelsen af dette papir har jeg modtaget megen støtte og hjælp. Jeg vil især gerne takke min holdkammerat XinPei Chen for hans vidunderlige samarbejde og patientstøtte under min operation.
0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
Arterial Clip | Braun | BH014R | |
Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
Petri Dishc 100×15 mm | VWR® | 391-0578 | |
Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
UT – 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |