Normothermic Ex Vivo Lever Machine Perfusie in Muis
Summary
Een normotherm ex vivo leverperfusie (NEVLP) systeem werd gecreëerd voor muizenlevers. Dit systeem vereist ervaring in microchirurgie, maar zorgt voor reproduceerbare perfusieresultaten. Het vermogen om muizenlevers te gebruiken vergemakkelijkt het onderzoek van moleculaire routes om nieuwe perfusaatadditieven te identificeren en maakt de uitvoering van experimenten gericht op orgaanherstel mogelijk.
Abstract
Dit protocol presenteert een geoptimaliseerd erytrocytenvrij NEVLP-systeem met behulp van muizenlevers. Ex vivo conservering van muizenlevers werd bereikt door gebruik te maken van gemodificeerde canules en technieken die waren aangepast aan conventionele commerciële ex vivo perfusieapparatuur. Het systeem werd gebruikt om de conserveringsresultaten na 12 uur perfusie te evalueren. C57BL / 6J-muizen dienden als leverdonoren en de levers werden geëxplanteerd door de poortader (PV) en galwegen (BD) te cannuleren en vervolgens het orgaan te spoelen met warme (37 ° C) gehepariniseerde zoutoplossing. Vervolgens werden de geëxplanteerde levers overgebracht naar de perfusiekamer en onderworpen aan normotherme zuurstofrijke machineperfusie (NEVLP). Inlaat- en uitlaatperfuaatmonsters werden met tussenpozen van 3 uur verzameld voor perfuaatanalyse. Na voltooiing van de perfusie werden levermonsters verkregen voor histologische analyse, waarbij de morfologische integriteit werd beoordeeld met behulp van gemodificeerde Suzuki-Score door hematoxyline-eosine (HE) kleuring. De optimalisatie-experimenten leverden de volgende bevindingen op: (1) muizen met een gewicht van meer dan 30 g werden geschikter geacht voor het experiment vanwege de grotere omvang van hun galwegen (BD). (2) een 2 Fr (buitendiameter = 0,66 mm) polyurethaan canule was beter geschikt voor het cannuleren van de poortader (PV) in vergelijking met een polypropyleen canule. Dit werd toegeschreven aan de verbeterde grip van het polyurethaanmateriaal, wat resulteerde in minder slippen van de katheter tijdens de overdracht van het lichaam naar de orgaankamer. (3) voor cannulatie van de galwegen (BD) bleek een polyurethaancanule van 1 Fr (buitendiameter = 0,33 mm) effectiever te zijn in vergelijking met de polypropyleen UT – 03 (buitendiameter = 0,30 mm) canule. Met dit geoptimaliseerde protocol werden muizenlevers met succes bewaard voor een duur van 12 uur zonder significante impact op de histologische structuur. Hematoxyline-eosine (HE) kleuring onthulde een goed bewaard gebleven morfologische architectuur van de lever, gekenmerkt door overwegend levensvatbare hepatocyten met duidelijk zichtbare kernen en milde verwijding van hepatische sinusoïden.
Introduction
Levertransplantatie vertegenwoordigt de gouden standaardbehandeling voor personen met een leverziekte in het eindstadium. Helaas overtreft de vraag naar donororganen het beschikbare aanbod, wat leidt tot een aanzienlijk tekort. In 2021 stonden ongeveer 24.936 patiënten op de wachtlijst voor een levertransplantatie, terwijl slechts 9.234 transplantaties succesvol werden uitgevoerd1. Het aanzienlijke verschil tussen vraag en aanbod van levertransplantaten benadrukt de dringende noodzaak om alternatieve strategieën te onderzoeken om de donorpool te verbreden en de toegankelijkheid van levertransplantaten te verbeteren. Een manier om de donorpool uit te breiden is het gebruik van marginale donoren2. Marginale donoren zijn mensen met gevorderde leeftijd, matige of ernstige steatose. Hoewel de transplantatie van marginale organen gunstige resultaten kan opleveren, blijven de algemene resultaten suboptimaal. Als gevolg hiervan is de ontwikkeling van therapeutische strategieën gericht op het verbeteren van de functie van marginale donoren momenteel aan de gang 3,4.
Een van de strategieën is om machineperfusie te gebruiken, met name normotherme zuurstofrijke machineperfusie, om de functie van deze marginale organen te verbeteren5. Er is echter nog steeds een beperkt begrip van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de gunstige effecten van normotherme zuurstofrijke machineperfusie (NEVLP). Muizen, met hun overvloedige beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde stammen, dienen als waardevolle modellen voor het onderzoeken van moleculaire routes. Bijvoorbeeld, het belang van autofagie pathways bij het verminderen van hepatische ischemie-reperfusie letsel is in toenemende mate erkend 6,7. Een belangrijke moleculaire route in de hepatische ischemie-reperfusie schade is de miR-20b-5p/ATG7 pathway8. Momenteel zijn er een aantal ATG knock-out en voorwaardelijke knock-out muizenstammen beschikbaar, maar geen overeenkomstige rattenstammen9.
Op basis van deze achtergrond was het doel om een geminiaturiseerd NEVLP-platform voor muizenlevertransplantaten te genereren. Dit platform zou de verkenning en evaluatie van potentiële genetisch gemodificeerde strategieën vergemakkelijken die gericht zijn op het verbeteren van de functionaliteit van de lever van de donor. Bovendien was het essentieel dat het systeem geschikt was voor langdurige perfusie, waardoor de ex vivo behandeling van de lever mogelijk werd, gewoonlijk “orgaanreparatie” genoemd.
Gezien de beperkte beschikbaarheid van relevante in vitro gegevens over leverperfusie bij muizen, richtte het literatuuronderzoek zich op studies uitgevoerd bij ratten. Een systematische zoektocht van literatuur van 2010 tot 2022 werd uitgevoerd met behulp van trefwoorden zoals “normotherme leverperfusie”, “ex vivo of in vitro” en “ratten“. Deze zoektocht was gericht op het identificeren van optimale omstandigheden bij knaagdieren, waardoor we de meest geschikte aanpak konden bepalen.
Het perfusiesysteem bestaat uit een afgesloten glazen bufferreservoir met watermantel, een peristaltische rollenpomp, een oxygenator, een bellenvanger, een warmtewisselaar, een orgelkamer en een gesloten cyclusbuizensysteem (figuur 1). Het systeem zorgt voor een nauwkeurige handhaving van een constante perfusietemperatuur van 37 °C met behulp van een speciale thermostatische machine. De peristaltische rollenpomp drijft de stroom van het perfusaat door het hele circuit aan. Het perfusiecircuit begint bij het geïsoleerde wateromhulde reservoir. Vervolgens wordt het perfusaat door de oxygenator geleid, die een gasmengsel van 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide uit een speciale gasfles ontvangt. Na oxygenatie passeert het perfusaat de bellenvanger, waarbij eventuele ingesloten bellen door de peristaltische pomp terug naar het reservoir worden geleid. Het resterende perfusaat stroomt door de warmtewisselaar en komt in de orgelkamer, van waaruit het terugkeert naar het reservoir.
Hier rapporteren we onze ervaringen met het opzetten van een NEVLP voor muizenlevers en delen we de veelbelovende resultaten van een proefexperiment uitgevoerd met behulp van het zuurstofrijke medium zonder zuurstofdragers.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritieke stappen in het protocol
De twee cruciale stappen bij leverexplantatie zijn de cannulatie van de poortader (PV) en de daaropvolgende cannulatie van het galkanaal (BD). Deze stappen zijn van het grootste belang voor het succesvol ophalen van organen en de daaropvolgende perfusie- of transplantatieprocedures.
Uitdagingen en oplossingen
PV-cannulatie brengt drie uitdagingen met zich mee: letsel van de vaatwand, verplaatsing van de katheter en uitvoe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tijdens het schrijven van dit artikel heb ik veel steun en hulp gekregen. Ik wil in het bijzonder mijn teamgenoot XinPei Chen bedanken voor zijn geweldige samenwerking en geduldige ondersteuning tijdens mijn operatie.
Materials
| 0.5 ml Micro Tube PP | Sarstedt | 72699 | |
| 1 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 10 µL Micro Syringe | Hamilton | 701N | |
| 2 Fr Rubber Cannula | Vygon | Sample Cannula | |
| 24 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+OF2419 | |
| 26 G Butterfly Cannula | Terumo | SR+DU2619WX | |
| 30 G Hypodermic Needle | Sterican | 100246 | |
| 50 ml Syringe Pump | Braun | 110356 | |
| 6-0 Perma-Hand Seide | Ethicon | 639H | |
| Arterial Clip | Braun | BH014R | |
| Autoclavable Moist Chamber | Hugo Sachs Elektronik | 73-4733 | |
| Big Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974018 | |
| Bubble Trap | Hugo-Sachs-Elektronik | V83163 | |
| Buprenovet (0.3 mg / ml) | Elanco | / | |
| CIDEX OPA solution (2 L) | Cilag GmbH | 20391 | |
| Electrosurgical Unit for Monopolar Cutting VIO® 50 C | ERBE | / | |
| Fetal Bovine Serum(500 ml) | Sigma-Aldrich | F7524-500ML | |
| Gas Mixture (95 % oxygen & 5 % carbon dioxide) | House Supply | / | |
| Heating Circulating Baths | Harvard-Apparatus | 75-0310 | |
| Heparin 5000 (I.E. /5 ml) | Braun | 1708.00.00 | |
| Hydrocortisone (100 mg / 2 ml) | Pfizer | 15427276 | |
| Insulin(100 IE / ml) | Sigma | I0516-5ML | |
| Iris Scissors | Fine Science Instruments | 15000-03 | |
| Isofluran (250 ml) | Cp-Pharma | 1214 | |
| Membrane Oxygenator | Hugo Sachs Elektronik | T18728 | |
| Microsurgery Microscope | Leica | M60 | |
| Mouse Retractor Set | Carfil Quality | 180000056 | |
| NanoZoomer 2.0 HT | Hamamatsu | / | |
| Non-Woven Sponges | Kompressen | 866110 | |
| Penicillin Streptomycin (1 mg / ml) | C.C.Pro | Z-13-M | |
| Perfusion Extension Tube (30 cm) | Braun | 4256000 | |
| Peristaltic Pump | Harvard-Apparatus | P-70 | |
| Petri Dishc 100×15 mm | VWR® | 391-0578 | |
| Povidon-Jod (Vet-Sep Spray) | Livisto | 799-416 | |
| Pressure Transducer Simulator | UTAH Medical Products | 650-950 | |
| Reusable Blood Pressure Transducers | AD Instruments | MLT-0380/D | |
| S & T Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Instruments | 00608-11 | |
| Small Cotton Applicator | NOBA Verbandmittel Danz GmbH | 974116 | |
| Straight Forceps 10 cm | Fine Science Instruments | 00632-11 | |
| Suture Tying Forceps | Fine Science Instruments | 11063-07 | |
| Syringe 50ml Original Perfusor | Braun | 8728810F-06 | |
| UT – 03 Cannula | Unique Medical, Japan | / | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Instruments | 15018-10 | |
| Veterinary Saline (500 ml) | WDT | 18X1807 | |
| Water Jacketed Reservoir 2 L | Harvard-Apparatus | 73-3441 | |
| William's E Medium (500 ML) | Thermofischer Scientific | A1217601 |
Referências
- Kwong, A. J., et al. OPTN/SRTR 2021 Annual data report: liver. American Journal of Transplantation. 23 (2), S178-S263 (2023).
- Linares, I., Hamar, M., Selzner, N., Selzner, M. Steatosis in Liver Transplantation: Current Limitations and Future Strategies. Transplantation. 103 (1), 78-90 (2019).
- Cheng, N., et al. Pharmacological activating transcription factor 6 activation is beneficial for liver retrieval with ex vivo normothermic mechanical perfusion from cardiac dead donor rats. Frontiers in Surgery. 8, 665260 (2021).
- Porte, R. J. Improved organ recovery after oxygen deprivation. Nature. 608 (7922), 273-274 (2022).
- Goumard, C., et al. Ex-Vivo Pharmacological Defatting of the Liver: A Review. Journal of Clinical Medicine. 10 (6), 1253 (2021).
- Mao, B., Yuan, W., Wu, F., Yan, Y., Wang, B. Autophagy in hepatic ischemia-reperfusion injury. Cell Death Discovery. 9 (1), 115 (2023).
- Hale, A. N., Ledbetter, D. J., Gawriluk, T. R., Rucker, E. B. Autophagy: regulation and role in development. Autophagy. 9 (7), 951-972 (2013).
- Tang, B., Bao, N., He, G., Wang, J. Long noncoding RNA HOTAIR regulates autophagy via the miR-20b-5p/ATG7 axis in hepatic ischemia/reperfusion injury. Gene. 686, 56-62 (2019).
- Kuma, A., Komatsu, M., Mizushima, N. Autophagy-monitoring and autophagy-deficient mice. Autophagy. 13 (10), 1619-1628 (2017).
- van der, V. a. l. k. . J. Fetal bovine serum-A cell culture dilemma. Science. 375 (6577), 143-144 (2022).
- Haque, O., et al. Twenty-four hour ex-vivo normothermic machine perfusion in rat livers. Technology (Singapore World Science). 8 (1-2), 27-36 (2020).
- Op den Dries, S., et al. Normothermic machine perfusion reduces bile duct injury and improves biliary epithelial function in rat donor livers. Liver Transplantation. 22 (7), 994-1005 (2016).
- Izamis, M. L., et al. Machine perfusion enhances hepatocyte isolation yields from ischemic livers. Cryobiology. 71 (2), 244-255 (2015).
- Gassner, J. M. G. V., et al. Improvement of normothermic ex vivo machine perfusion of rat liver grafts by dialysis and kupffer cell inhibition with glycine. Liver Transplantation. 25 (2), 275-287 (2019).
- Casado, J., et al. Rat splanchnic net oxygen consumption, energy implications. The Journal of Physiology. 431, 557-569 (1990).
- Tolboom, H., et al. A model for normothermic preservation of the rat liver. Tissue Engineering. 13 (8), 2143-2151 (2007).
- Yamada, S., et al. Effects of short-term normothermic and subnormothermic perfusion after cold preservation on liver transplantation from donors after cardiac death. Transplantation Proceedings. 52 (6), 1639-1642 (2020).
- Behrends, M., et al. Acute hyperglycemia worsens hepatic ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of Gastrointestinal Surgery. 14 (3), 528-535 (2010).
- Tolboom, H., et al. Sequential cold storage and normothermic perfusion of the ischemic rat liver. Transplant Proceeding. 40 (5), 1306-1309 (2008).
- Daemen, M. J., et al. Liver blood flow measurement in the rat. The electromagnetic versus the microsphere and the clearance methods. Journal of Pharmacological Methods. 21 (4), 287-297 (1989).
- Koo, A., Liang, I. Y. Microvascular filling pattern in rat liver sinusoids during vagal stimulation. The Journal of physiology. 295, 191-199 (1979).
- Beal, E. W., et al. [D-Ala2, D-Leu5] Enkephalin improves liver preservation during normothermic ex vivo perfusion. Journal of Surgical Research. 241, 323-335 (2019).
- Birnie, J. H., Grayson, J. Observations on temperature distribution and liver blood flow in the rat. The Journal of Physiology. 116 (2), 189-201 (1952).
- Silitonga, M., Silitonga, P. M. Haematological profile of rats (Rattus norvegicus) induced BCG and provided leaf extract of Plectranthus amboinicus Lour Spreng). AIP Conference Proceedings. 1868, 090008090008 (2017).
- Jacob Filho, W., et al. Reference database of hematological parameters for growing and aging rats. Aging Male. 21 (2), 145-148 (2018).
- Tian, X., et al. Heme oxygenase-1-modified bone marrow mesenchymal stem cells combined with normothermic machine perfusion repairs bile duct injury in a rat model of DCD liver transplantation via activation of peribiliary glands through the Wnt pathway. Stem Cells International. 2021, 9935370 (2021).
- Yang, L., et al. Normothermic machine perfusion combined with bone marrow mesenchymal stem cells improves the oxidative stress response and mitochondrial function in rat donation after circulatory death livers. Stem Cells Development. 29 (13), 835-852 (2020).
- Wang, L., He, H. W., Zhou, X., Long, Y. Ursodeoxycholic Acid (UDCA) promotes lactate metabolism in mouse hepatocytes through cholic acid (CA) – farnesoid x receptor (FXR) pathway. Current Molecular Medicine. 20 (8), 661-666 (2020).
- Akateh, C., Beal, E. W., Whitson, B. A., Black, S. M. Normothermic ex-vivo liver perfusion and the clinical implications for liver transplantation. Journal of Clinical and Translational Hepatology. 6 (3), 276-282 (2018).
- Westerkamp, A. C., et al. Metformin preconditioning improves hepatobiliary function and reduces injury in a rat model of normothermic machine perfusion and orthotopic transplantation. Transplantation. 104 (9), e271-e280 (2020).
- Nösser, M., et al. Development of a rat liver machine perfusion system for normothermic and subnormothermic conditions. Tissue Engineering. Part A. 26 (1-2), 57-65 (2020).
- Yao, J., et al. Extracellular vesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells alleviate rat hepatic ischemia-reperfusion injury by suppressing oxidative stress and neutrophil inflammatory response. FASEB Journal. 33 (2), 1695-1710 (2019).
- Haque, O., et al. The effect of blood cells retained in rat livers during static cold storage on viability outcomes during normothermic machine perfusion. Scientific Reports. 11 (1), 23128 (2021).
- Gillooly, A. R., Perry, J., Martins, P. N. First report of siRNA uptake (for RNA interference) during ex vivo hypothermic and normothermic liver machine perfusion. Transplantation. 103 (3), e56-e57 (2019).
- Beal, E. W., et al. A small animal model of ex vivo normothermic liver perfusion. Journal of visualized experiments. (136), e57541 (2018).
- Claussen, F., et al. Dual versus single vessel normothermic ex vivo perfusion of rat liver grafts using metamizole for vasodilatation. PLoS One. 15 (7), (2020).
- Yang, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells combine with normothermic machine perfusion to improve rat donor liver quality-the important role of hepatic microcirculation in donation after circulatory death. Cell and Tissue Research. 381 (2), 239-254 (2020).
- Wu, L., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells modified with heme oxygenase-1 alleviate rejection of donation after circulatory death liver transplantation by inhibiting dendritic cell maturation in rats. International Immunopharmacology. 107, 108643 (2022).
- Lonati, C., et al. Quantitative Metabolomics of Tissue, Perfusate, and Bile from Rat Livers Subjected to Normothermic Machine Perfusion. Biomedicines. 10 (3), (2022).
- Oldani, G., et al. The impact of short-term machine perfusion on the risk of cancer recurrence after rat liver transplantation with donors after circulatory death. PLoS One. 14 (11), e0224890 (2019).
- Abraham, N., et al. Two compartment evaluation of liver grafts during acellular room temperature machine perfusion (acRTMP) in a rat liver transplant model. Frontiers in Medicine (Lausanne). 9, 804834 (2022).
- Scheuermann, U., et al. Sirtuin-1 expression and activity is diminished in aged liver grafts. Scientific Reports. 10 (1), 11860 (2020).
- Scheuermann, U., et al. Damage-associated molecular patterns induce inflammatory injury during machine preservation of the liver: potential targets to enhance a promising technology. Liver Transplantation. 25 (4), 610-626 (2019).
- Carnevale, M. E., et al. The novel N, N-bis-2-hydroxyethyl-2-aminoethanesulfonic acid-gluconate-polyethylene glycol-hypothermic machine perfusion solution improves static cold storage and reduces ischemia/reperfusion injury in rat liver transplant. Liver Transplantation. 25 (9), 1375-1386 (2019).
- Von, C., Horn, H., Zlatev, J., Pletz, B., Lüer, T., Minor, Comparison of thermal variations in post-retrieval graft conditioning on rat livers. Artificial Organs. 46 (2), 239-245 (2022).
- Tomizawa, M., et al. Oncostatin M in William’s E medium is suitable for initiation of hepatocyte differentiation in human induced pluripotent stem cells. Molecular Medicine Reports. 15 (5), 3088-3092 (2017).
- Dondossola, D., et al. Human red blood cells as oxygen carriers to improve ex-situ liver perfusion in a rat model. Journal of Clinical medicine. 8 (11), (2019).
- Jägers, J., Wrobeln, A., Ferenz, K. B. Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology. European Journal of Physiology. 473 (2), 139-150 (2021).
- Jia, J., et al. A promising ex vivo liver protection strategy: machine perfusion and repair. Surgery and Nutrition. 8 (2), 142-143 (2019).
- Jennings, H., et al. The immunological effect of oxygen carriers on normothermic ex vivo liver perfusion. Frontiers in Immunology. 13, 833243 (2022).
- Kim, J. S., et al. Carbamazepine suppresses calpain-mediated autophagy impairment after ischemia/reperfusion in mouse livers. Toxicology and Applied Pharmacology. 273 (3), 600-610 (2013).
- Imber, C. J., et al. Advantages of normothermic perfusion over cold storage in liver preservation. Transplantation. 73 (5), 701-709 (2002).
- Tolboom, H., et al. Recovery of warm ischemic rat liver grafts by normothermic extracorporeal perfusion. Transplantation. 87 (2), 170-177 (2009).
- Rigo, F., Navarro-Tableros, V., De Stefano, N., Calleri, N., Romagnoli, A. Ex vivo normothermic hypoxic rat liver perfusion model: an experimental setting for organ recondition and pharmacological intervention. Methods in Molecular Biology. 2269, 139-150 (2021).
- van Dyk, J. C., Pieterse, G. M., van Vuren, J. H. Histological changes in the liver of Oreochromis mossambicus (Cichlidae) after exposure to cadmium and zinc. Ecotoxicology and Environmental Safety. 66 (3), 432-440 (2007).
