Усовершенствованный метод изоляции митохондриальных контактных участков

Summary

Митохондриальные контактные сайты представляют собой белковые комплексы, которые взаимодействуют с митохондриальными внутренними и внешними мембранными белками. Эти участки необходимы для связи между митохондриальными мембранами и, таким образом, между цитозолем и митохондриальным матриксом. В этой статье мы опишем метод выявления кандидатов, подходящих для этого конкретного класса белков.

Abstract

Митохондрии присутствуют практически во всех эукариотических клетках и выполняют важнейшие функции, выходящие далеко за рамки производства энергии, например, синтез железо-серных кластеров, липидов или белков, буферизацию^Ca2+ и индукцию апоптоза. Кроме того, митохондриальная дисфункция приводит к тяжелым заболеваниям человека, таким как рак, диабет и нейродегенерация. Для того, чтобы выполнять эти функции, митохондрии должны взаимодействовать с остальной частью клетки через свою оболочку, состоящую из двух мембран. Поэтому эти две мембраны должны постоянно взаимодействовать. Белковые контактные участки между внутренней и внешней мембранами митохондрий имеют важное значение в этом отношении. На данный момент выявлено несколько мест контакта. В описанном здесь методе митохондрии Saccharomyces cerevisiae используются для выделения контактных сайтов и, таким образом, идентификации кандидатов, которые квалифицируются для белков контактных сайтов. Мы использовали этот метод для идентификации митохондриального контактного сайта и комплекса организующей системы cristae (MICOS), одного из основных контактных сайтов-образующих комплексов во внутренней мембране митохондрий, который сохраняется от дрожжей до человека. Недавно мы усовершенствовали этот метод, чтобы идентифицировать новый контактный сайт, состоящий из Cqd1 и комплекса Por1-Om14.

Introduction

Митохондрии выполняют множество различных функций у эукариот, наиболее известной из которых является производство АТФ путем окислительного фосфорилирования. Другие функции включают производство железо-серных кластеров, синтез липидов, а у высших эукариот — передачу сигналов Ca²⁺ и индукцию апоптоза 1,2,3,4. Эти функции неразрывно связаны с их сложной ультраструктурой.

Митохондриальная ультраструктура была впервые описана с помощью электронной микроскопии⁵. Показано, что митохондрии представляют собой достаточно сложные органеллы, состоящие из двух мембран: митохондриальной наружной мембраны и митохондриальной внутренней мембраны. Таким образом, этими мембранами образуются два водных компартмента: межмембранное пространство и матрикс. Митохондриальная внутренняя мембрана может быть еще более разделена на различные секции. Внутренняя пограничная мембрана находится в непосредственной близости от наружной, а кристы образуют инвагинации. Так называемые кристальные соединения соединяют внутреннюю пограничную мембрану и кристы (рис. 1). Кроме того, электронные микрофотографии осмотически сморщенных митохондрий показывают, что существуют участки, в которых митохондриальные мембраны плотно соединены ^6,7. Эти так называемые контактные участки образованы белковыми комплексами, охватывающими две мембраны (рис. 1). Считается, что эти сайты взаимодействия необходимы для жизнеспособности клеток из-за их важности для регуляции митохондриальной динамики и наследования, а также передачи метаболитов и сигналов между цитозолью и матриксом⁸.

Комплекс MICOS во внутренней мембране митохондрий, вероятно, является наиболее охарактеризованным и наиболее универсальным контактным сайтообразующим комплексом. MICOS был описан у дрожжей в 2011 году и состоит из шести субъединиц 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19^, Mic12 и ^Mic10. Они образуют комплекс примерно в 1,5 МДа, который локализуется в кристальных соединениях 9,10,11. Удаление одной из основных субъединиц, Mic10 или Mic60, приводит к отсутствию этого комплекса ^9,11, что означает, что эти две субъединицы необходимы для стабильности MICOS. Интересно, что MICOS образует не один, а несколько сайтов контакта с различными белками и комплексами митохондриальной внешней мембраны: комплексом TOM 11,12, комплексом TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, комплексом Fzo1-Ugo1⁹, Por1 10^, OM45 10 и Miro ¹⁷. Это убедительно указывает на то, что комплекс MICOS участвует в различных митохондриальных процессах, таких как импорт белка, метаболизм фосфолипидов и генерация митохондриальной ультраструктуры¹⁸. Последняя функция, вероятно, является основной функцией MICOS, поскольку отсутствие комплекса MICOS, индуцированного делецией MIC10 или MIC60, приводит к аномальной ультраструктуре митохондрий, в которой практически полностью отсутствуют регулярные кристы. Вместо этого внутренние мембранные везикулы без соединения с внутренней пограничной мембраной накапливают^{19, 20}. Важно отметить, что MICOS сохраняется по форме и функциям от дрожжей до человека²¹. Связь мутаций в субъединицах MICOS с тяжелыми заболеваниями человека также подчеркивает ее важность для высших эукариот^22,23. Несмотря на то, что MICOS очень универсален, необходимо наличие дополнительных мест контакта (на основании наших неопубликованных наблюдений). Действительно, было идентифицировано несколько других мест контакта, например, механизмы митохондриального слияния Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 или Mdm31-Por1^, который участвует в биосинтезе митохондриально-специфического фосфолипидного кардиолипина ²⁷. Недавно мы усовершенствовали метод, который привел нас к идентификации MICOS для идентификации Cqd1 как части нового контактного сайта, образованного с внешним мембранным комплексом Por1-Om14²⁸. Интересно, что этот контактный сайт также, по-видимому, участвует во многих процессах, таких как гомеостаз митохондриальных мембран, метаболизм фосфолипидов и распределение коэнзима Q^28,29.

Здесь мы использовали вариацию ранее описанного фракционирования митохондрий 9,30,31,32,33. Осмотическая обработка митохондрий приводит к разрушению митохондриальной внешней мембраны и к уменьшению матричного пространства, оставляя две мембраны только в непосредственной близости в местах контакта. Это позволяет генерировать везикулы, состоящие исключительно из митохондриальной внешней мембраны или митохондриальной внутренней мембраны или в местах контакта обеих мембран с помощью мягкого ультразвукового воздействия. Из-за того, что внутренняя мембрана митохондрий обладает гораздо более высоким соотношением белка к липидам, пузырьки внутренней мембраны митохондрий демонстрируют более высокую плотность по сравнению с пузырьками внешней мембраны митохондрий. Разница в плотности может быть использована для разделения мембранных везикул с помощью центрифугирования с градиентом плотности сахарозы. Таким образом, пузырьки внешней мембраны митохондрий накапливаются при низких концентрациях сахарозы, в то время как пузырьки внутренней мембраны митохондрий обогащаются при высоких концентрациях сахарозы. Везикулы, содержащие контактные участки, концентрируются в промежуточных концентрациях сахарозы (рис. 2). Следующий протокол подробно описывает этот усовершенствованный метод, который требует меньше специализированного оборудования, времени и энергии по сравнению с нашим ранее разработанным методом32 и предоставляет полезный инструмент для идентификации возможных белков контактного сайта.

Protocol

1. Буферы и складские растворы Раствор 1 М 3-морфолинопропан-1-сульфоновой кислоты (MOPS) в деионизированной воде, рН 7,4. Хранить при температуре 4 °C. Приготовьте 500 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в деионизированной воде, рН 8,0. Хранить при комнатной температур…

Representative Results

Относительно легко разделить внутреннюю и внешнюю мембраны митохондрий. Однако генерация и разделение пузырьков, содержащих контактный сайт, значительно сложнее. На наш взгляд, важными и важными являются два этапа: условия ультразвуковой обработки и используемый градиент. <p class="jove_c…

Discussion

Митохондриальное субфракционирование представляет собой сложный эксперимент с несколькими очень сложными этапами. Поэтому мы стремились к дальнейшему совершенствованию и, в определенной степени, к упрощению нашего устоявшегося метода³². Здесь сложность заключалась в то…

Materials

13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm	Beckman Instruments, Germany	344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm	Beckman Instruments, Germany	363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g	Beckman Instruments, Germany	363055
Abbe refractometer	Zeiss, Germany		discontinued, any pipet controller will suffice
accu-jet pro Pipet Controller	Brandtech, USA	BR26320	discontinued, any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mL	DWK Life Science, Germany	C118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 D	Branson Ultrasonics, USA	FIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP	Branson Ultrasonics, USA	101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell	Branson Ultrasonics, USA	15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26	Beckman Instruments, Germany	B37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultra	Beckman Instruments, Germany	8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail	Roche, Switzerland	11697498001
D-Sorbit	Roth, Germany	6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)	Roth, Germany	8043
Erlenmeyer flask, 100 mL	Roth, Germany	X747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1	Hirschmann, Germany	1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05	Hirschmann, Germany	1180153
ice bath	neoLab, Germany	S12651
Magnetic stirrer RCT basic	IKA-Werke GmbH, Germany	Z645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)	Gerbu, Germany	1081
MyPipetman Select P1000	Gilson, USA	FP10006S
MyPipetman Select P20	Gilson, USA	FP10003S
MyPipetman Select P200	Gilson, USA	FP10005S
Omnifix 1 mL	Braun, Germany	4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Serva, Germany	32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8×120 mm	Braun, Germany	4022495052414
stirring bar, 15 mm	VWR, USA	442-0366
Sucrose	Merck, Germany	S8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Instruments, Germany	331362
Test tubes	Eppendorf, Germany	3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel	VWR, USA	432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip	VWR, USA	432-0212
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma Aldrich, Germany	33731	discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRIS	Roth, Germany	4855