فحص وحدة تشكيل المستعمرات الدقيقة لتقييم فعالية اللقاحات ضد السل
Summary
تحديد وحدات تشكيل المستعمرات (CFU) هو الأسلوب القياسي الذهبي لقياس البكتيريا ، بما في ذلك المتفطرة السلية التي قد تستغرق أسابيع لتشكيل مستعمرات مرئية. هنا نصف وحدة CFU الصغيرة لتحديد CFU مع زيادة كفاءة الوقت ، وتقليل مساحة المختبر وتكلفة الكاشف ، وقابلية التوسع في تجارب الإنتاجية المتوسطة والعالية.
Abstract
قتل السل (TB) ، وهو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم بسبب عامل معدي ، 1.6 مليون شخص في عام 2022 ، ولم يتجاوزه سوى COVID-19 خلال جائحة 2019-2021. هذا المرض ناجم عن بكتيريا المتفطرة السلية (M.tb). سلالة المتفطرة البوفية Bacillus Calmette-Guérin (BCG) ، لقاح السل الوحيد ، هي أقدم لقاح مرخص في العالم ، ولا يزال قيد الاستخدام. حاليا ، هناك 12 لقاحا في التجارب السريرية وعشرات اللقاحات قيد التطوير قبل السريري. الطريقة المفضلة المستخدمة لتقييم فعالية لقاحات السل في الدراسات قبل السريرية هي تعداد المستعمرات البكتيرية بواسطة فحص وحدات تكوين المستعمرات (CFU). يستغرق هذا الفحص الذي يستغرق وقتا طويلا من 4 إلى 6 أسابيع حتى ينتهي ، ويتطلب مساحة كبيرة للمختبر والحاضنة ، وله تكاليف كاشف عالية ، وعرضة للتلوث. نصف هنا طريقة محسنة لتعداد المستعمرات ، وهي micro-CFU (mCFU) ، والتي تقدم حلا بسيطا وسريعا لتحليل نتائج فعالية لقاح السل . يتطلب اختبار mCFU كواشف أقل بعشرة أضعاف ، ويقلل من فترة الحضانة ثلاثة أضعاف ، ويستغرق من 1 إلى 2 أسابيع للانتهاء ، ويقلل من مساحة المختبر وتكلفة الكاشف ، ويقلل من مخاطر الصحة والسلامة المرتبطة بالعمل مع أعداد كبيرة من M.tb. علاوة على ذلك ، لتقييم فعالية لقاح السل ، يمكن الحصول على عينات من مجموعة متنوعة من المصادر ، بما في ذلك الأنسجة من الملقحة المصابة بالمتفطرات. كما وصفنا طريقة محسنة لإنتاج ثقافة متفطرات أحادية الخلية وموحدة وعالية الجودة لدراسات العدوى. وأخيرا، نقترح اعتماد هذه الأساليب عالميا في الدراسات قبل السريرية لتحديد فعالية اللقاح، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى تقليل الوقت في تطوير لقاحات ضد السل.
Introduction
السل (TB) هو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم من قبل عامل معدي واحد ، بكتيريا المتفطرة السلية (M.tb) ، مما يؤدي إلى مقتل عدد أكبر من الناس أكثر من أي ممرض آخر. في عام 2021 ، كان السل مسؤولا عن 1.6 مليون حالة وفاة وتجاوزه COVID-19 خلال جائحة 2019-20211. علاوة على ذلك ، وفقا لتقرير السل العالمي الصادر عن منظمة الصحة العالمية لعام 2022 ، كانت جائحة COVID-19 مسؤولة عن زيادة حالات السل الجديدة. كما أبلغت منظمة الصحة العالمية عن انخفاض كبير في عدد الأشخاص الذين تم تشخيص إصابتهم بالسل خلال هذه الفترة ، مما قد يزيد من عدد حالات السل1.
Bacillus Calmette-Guérin (BCG) هي سلالة حية موهنة من المتفطرة البوفية المسببة للأمراض ، والتي استخدمت لأول مرة كلقاح منذ أكثر من 100 عام. هذا هو اللقاح الوحيد ضد السل وهو أقدم لقاح مرخص في العالم لا يزال قيد الاستخدام 2,3. حاليا ، هناك 12 لقاحا في مراحل مختلفة من التجارب السريرية4 ، وعشرات اللقاحات قيد التطوير قبل السريري 5,6. يشمل التقييم قبل السريري للقاحات ضد السل تقييم السلامة والمناعة7 ، والتي يمكن الحصول عليها في نماذج حيوانية متنوعة مثل الزرد والفئران وخنازير غينيا والأرانب والماشية والرئيسيات غير البشرية8،9،10. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب تقييم قدرة اللقاح على تحفيز الحماية من عدوى السل المتعدد الأطراف و / أو انتقاله ، أي فعالية اللقاح ، تحدي السل متعدد السل في الجسم الحي 5,11. ومن المثير للاهتمام ، أن تطعيم BCG يحفز تأثيرات غير محددة تؤثر على بقاء مسببات الأمراض البكتيرية والفيروسية الأخرى12,13 من خلال آلية المناعة المدربة14. لتحديد العبء البكتيري القابل للحياة في مصاب ، فإن الطريقة المفضلة هي تعداد المستعمرات البكتيرية من خلال فحص وحدات تكوين المستعمرات (CFU) 5,15. CFU هي وحدة تقدر عدد الكائنات الحية الدقيقة (البكتيريا أو الفطريات) التي تشكل مستعمرات في ظل ظروف نمو محددة. تنشأ وحدات CFU من الكائنات الحية الدقيقة القابلة للحياة والقابلة للتكرار ، ويصعب تقدير العدد المطلق للكائنات الحية الدقيقة داخل كل مستعمرة. من غير المؤكد ما إذا كانت المستعمرة قد نشأت من واحد أو أكثر من الكائنات الحية الدقيقة. تعكس وحدة CFU عدم اليقين هذا ، وبالتالي يمكن ملاحظة تباين كبير في النسخ المتماثلة لنفس العينة. يتطلب هذا الفحص الذي يستغرق وقتا طويلا فنيين متخصصين مدربين للعمل في مرفق من مستوى السلامة الأحيائية 3 (BSL3) ، ومساحة كبيرة للمختبر والحاضنة ، ويستغرق من 4 إلى 6 أسابيع للانتهاء ، وهو عرضة للتلوث.
في هذه الدراسة ، وصفنا طريقة محسنة لتعداد المستعمرات ، micro-CFU (mCFU) ، ونقدم حلا بسيطا وسريعا لتحليل النتائج15،16،17،18،19،20. يتطلب اختبار mCFU كواشف أقل بعشرة أضعاف ، ويقلل من فترة الحضانة ثلاثة أضعاف ، ويستغرق من 1 إلى 2 أسابيع للانتهاء ، ويقلل من مساحة المختبر وتكلفة الكاشف ، ويقلل من مخاطر الصحة والسلامة المرتبطة بالعمل مع أعداد كبيرة من M.tb. نقترح اعتماد هذه الطريقة عالميا للدراسات قبل السريرية لتحديد فعالية اللقاح ، مما يؤدي في النهاية إلى تقليل الوقت في تطوير لقاحات ضد السل. أخيرا ، تم استخدام هذه الطريقة المثلى لتعداد CFU لتحديد ليس فقط المتفطرات ولكن أيضا البكتيريا الأخرى ، مثل الإشريكية القولونية ورالستونيا سولاناسيروم21.
Protocol
Representative Results
Discussion
السل مشكلة صحية عمومية هامة تزداد أهميتها، ولا سيما في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل. تسبب تعطل أماكن الرعاية الصحية لتشخيص السل وعلاجه أثناء جائحة كوفيد-19 في تأثير سلبي على حدوث الحالات الجديدة1. وبالإضافة إلى ذلك، يجب التصدي على وجه الاستعجال لسلالات السل المتعددة …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بتمويل داخلي من كلية الطب ، الجامعة الكاثوليكية البرتغالية ، وتمويل خارجي من Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) ، في إطار المنح UIDP / 04279/2020 و UIDB / 04279/2020 و EXPL / SAU-INF / 0742/2021.
Materials
| 96-well plates | VWR | 734-2781 | |
| DSLR 15-55 mm lens | Nikon | AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR | |
| DSLR camera | Nikon | D3400 | |
| DSLR macro lens | Sigma | MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM | |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270106 | |
| Fiji Software | https://fiji.sc/ | Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included. | |
| Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich | 18896 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Middlebrook 7H10 | BD | 262710 | |
| Middlebrook 7H9 | BD | 271310 | |
| Multichannel pipette (0.5 – 10 µl) | Gilson | FA10013 | |
| Multichannel pipette (20 – 200 µl) | Gilson | FA10011 | |
| Mycobacterium bovis BCG | American Type Culture Collection | ATCC35734 | strain TMC 1011 [BCG Pasteur] |
| OADC enrichment | BD | 211886 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | NZYTech | MB25201 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875091 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Spectrophotometer UV-6300PC | VWR | 634-6041 | |
| Square Petri dish 120 x 120 mm | Corning | BP124-05 | |
| Tyloxapol | Sigma-Aldrich | T8761 | |
| Ultrasound bath Elma P 30 H | VWR | 142-0051 |
Referências
- World Health Organization. . Global Tuberculosis Report 2022. , (2022).
- Bettencourt, P. J. G., Joosten, S. A., Lindestam Arlehamn, C. S., Behr, M. A., Locht, C., Neyrolles, O. 100 years of the Bacillus Calmette-Guérin vaccine. Vaccine. 39 (50), 7221-7222 (2021).
- Bettencourt, P. J. G. The 100th anniversary of bacille Calmette-Guérin (BCG) and the latest vaccines against COVID-19. The International Journal of Tuberculosis and Lung Disease. 25 (8), 611-613 (2021).
- Scriba, T. J., Netea, M. G., Ginsberg, A. M. Key recent advances in TB vaccine development and understanding of protective immune responses against Mycobacterium tuberculosis. Seminars in Immunology. 50, 101431 (2020).
- McShane, H., Williams, A. A review of preclinical animal models utilised for TB vaccine evaluation in the context of recent human efficacy data. Tuberculosis. 94 (2), 105-110 (2014).
- Voss, G., et al. Progress and challenges in TB vaccine development. F1000Research. 7, 199 (2018).
- Satti, I., McShane, H. Current approaches toward identifying a correlate of immune protection from tuberculosis. Expert Review of Vaccines. 18 (1), 43-59 (2019).
- Young, D. Animal models of tuberculosis. European Journal of Immunology. 39 (8), 2011-2014 (2009).
- Pedroza-Roldán, C., Flores-Valdez, M. A. Recent mouse models and vaccine candidates for preventing chronic/latent tuberculosis infection and its reactivation. Pathogens and disease. 75 (6), (2017).
- Gong, W., Liang, Y., Wu, X. Animal Models of Tuberculosis Vaccine Research: An Important Component in the Fight against Tuberculosis. BioMed Research International. 2020, 1-21 (2020).
- Bettencourt, P., et al. Identification of antigens presented by MHC for vaccines against tuberculosis. NPJ vaccines. 5 (1), 2 (2020).
- Moorlag, S. J. C. F. M., Arts, R. J. W., van Crevel, R., Netea, M. G. Non-specific effects of BCG vaccine on viral infections. Clinical Microbiology and Infection. 25 (12), 1473-1478 (2019).
- Wilkie, M., et al. Functional in-vitro evaluation of the non-specific effects of BCG vaccination in a randomised controlled clinical study. Scientific Reports. 12 (1), 7808 (2022).
- Netea, M. G., et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 352 (6284), aaf1098 (2016).
- Bettencourt, P., Pires, D., Carmo, N., Anes, E. Application of Confocal Microscopy for Quantification of Intracellular Mycobacteria in Macrophages. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. 1, 614-621 (2010).
- Bettencourt, P., Carmo, N., Pires, D., Timóteo, P., Anes, E. Mycobacterial infection of macrophages: the effect of the multiplicity of infection. Antimicrobial research: Novel bioknowledge and educational programs. , 651-664 (2017).
- Pires, D., Bettencourt, P., Carmo, N., Niederweis, M., Anes, E. Role of Mycobacterium tuberculosis outer-membrane porins in bacterial survival within macrophages. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1113 (2010).
- Pires, D., et al. Mycobacterium tuberculosis Modulates miR-106b-5p to Control Cathepsin S Expression Resulting in Higher Pathogen Survival and Poor T-Cell Activation. Frontiers in immunology. 8 (DEC), 1819 (2017).
- Pires, D., et al. Role of Cathepsins in Mycobacterium tuberculosis Survival in Human Macrophages. Scientific reports. 6 (August), 32247 (2016).
- Bettencourt, P., et al. Actin-binding protein regulation by microRNAs as a novel microbial strategy to modulate phagocytosis by host cells: the case of N-Wasp and miR-142-3p. Frontiers in cellular and infection microbiology. 3 (June), 19 (2013).
- Bhuyan, S., et al. Microliter spotting and micro-colony observation: A rapid and simple approach for counting bacterial colony forming units. Journal of Microbiological Methods. 207, 106707 (2023).
- Jackson, S., McShane, H. Challenges in Developing a Controlled Human Tuberculosis Challenge Model. Current topics in microbiology and immunology. , 1-27 (2022).
- Darrah, P. A., et al. Prevention of tuberculosis in macaques after intravenous BCG immunization. Nature. 577 (7788), 95-102 (2020).
- Madura Larsen, J., et al. BCG stimulated dendritic cells induce an interleukin-10 producing T-cell population with no T helper 1 or T helper 2 bias in vitro. Immunology. 121 (2), 276-282 (2007).
- Bickett, T. E., et al. Characterizing the BCG-Induced Macrophage and Neutrophil Mechanisms for Defense Against Mycobacterium tuberculosis. Frontiers in immunology. 11, 1202 (2020).
- Pires, D., et al. Interference of Mycobacterium tuberculosis with the endocytic pathways on macrophages and dendritic cells from healthy donors: role of cathepsins. Drug Discovery Today. 15 (23-24), 1112-1112 (2010).
- Betts, G., et al. Optimising Immunogenicity with Viral Vectors: Mixing MVA and HAdV-5 Expressing the Mycobacterial Antigen Ag85A in a Single Injection. PLoS ONE. 7 (12), e50447 (2012).
- Tanner, R., et al. The influence of haemoglobin and iron on in vitro mycobacterial growth inhibition assays. Scientific reports. 7 (1), 43478 (2017).
- McNeill, E., et al. Regulation of mycobacterial infection by macrophage Gch1 and tetrahydrobiopterin. Nature communications. 9 (1), 5409 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pereira, M., Vale, N. Saquinavir: From HIV to COVID-19 and Cancer Treatment. Biomolecules. 12 (7), 944 (2022).
- Pires, D., et al. Repurposing Saquinavir for Host-Directed Therapy to Control Mycobacterium Tuberculosis Infection. Frontiers in immunology. 12, 647728 (2021).
- Pires, D., et al. Liposomal Delivery of Saquinavir to Macrophages Overcomes Cathepsin Blockade by Mycobacterium tuberculosis and Helps Control the Phagosomal Replicative Niches. International journal of molecular sciences. 24 (2), (2023).
- Maartens, G., Wilkinson, R. J. Tuberculosis. The Lancet. 370 (9604), 2030-2043 (2007).
- Matarazzo, L., Bettencourt, P. J. G. mRNA vaccines: a new opportunity for malaria, tuberculosis and HIV. Frontiers in Immunology. 14, 1172691 (2023).
- Young, D., Dye, C. The Development and Impact of Tuberculosis Vaccines. Cell. 124 (4), 683-687 (2006).
- Kommareddi, S., Abramowsky, C. R., Swinehart, G. L., Hrabak, L. Nontuberculous mycobacterial infections: Comparison of the fluorescent auramine-o and Ziehl-Neelsen techniques in tissue diagnosis. Human Pathology. 15 (11), 1085-1089 (1984).
- Sabiiti, W., et al. A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA). Journal of visualized experiments: JoVE. (158), e60460 (2020).
- Somoskövi, A., et al. Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen Medium. Journal of Clinical Microbiology. 38 (6), 2395-2397 (2000).
- Tanner, R., et al. The in vitro direct mycobacterial growth inhibition assay (MGIA) for the early evaluation of TB vaccine candidates and assessment of protective immunity: a protocol for non-human primate cells. F1000Research. 10, 257 (2021).
