כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לעבודה עם Limosilactobacillus reuteri DSM20016, המפרטים צמיחה, טרנספורמציה פלסמיד, PCR מושבה, מדידת חלבון מדווח פלואורסצנטי, ומיני הכנת פלסמיד מוגבלת, כמו גם בעיות נפוצות ופתרון בעיות. פרוטוקולים אלה מאפשרים מדידה של חלבוני כתב DSM20016, או אישור באמצעות PCR מושבה אם אין מדווח מעורב.
לקטובצילוס היה סוג גדול ומגוון להפליא של חיידקים שכלל 261 מינים, כמה מהם זנים קומנסליים עם פוטנציאל לשימוש כמארז למאמצים ביולוגיים סינתטיים במערכת העיכול. השונות הפנוטיפית והגנוטיפית הרחבה שנצפתה בתוך הסוג הובילה לאחרונה לסיווג מחדש ולהכנסת 23 סוגים חדשים.
בשל רוחב הווריאציות בתוך הז’אנר הישן, פרוטוקולים שהודגמו בחבר אחד עשויים שלא לעבוד כפי שפורסם עם חברים אחרים. מחסור במידע מרוכז על איך בדיוק לתפעל זנים ספציפיים הוביל למגוון גישות אד-הוק , שלעתים קרובות מותאמות ממשפחות חיידקים אחרות. זה יכול לסבך את העניינים עבור חוקרים מתחילים בתחום, שאולי לא יודעים איזה מידע חל או לא חל על הזן הנבחר שלהם.
במאמר זה, אנו שואפים לרכז סדרה של פרוטוקולים עם הצלחה מוכחת, במיוחד בכינוי זן Limosilactobacillus reuteri F275 (מספרי איסוף אחרים: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), יחד עם ייעוץ לפתרון בעיות ובעיות נפוצות שאדם עשוי להיתקל בהן. פרוטוקולים אלה אמורים לאפשר לחוקר עם ניסיון מועט, אם בכלל, בעבודה עם L. reuteri DSM20016 לשנות פלסמיד, לאשר טרנספורמציה ולמדוד משוב מערכת בקורא צלחות באמצעות חלבון כתב.
הסוג לקטובצילוס סווג היסטורית כגראם-חיובי, בצורת מוט, שאינו יוצר נבגים, אנארובים פקולטטיביים או מיקרו-אירופילים המפרקים סוכרים לייצור חומצה לקטית1. קריטריונים רופפים אלה הובילו לכך שלקטובצילוס היה, מבחינה פנוטיפית וגנוטיפית, סוג מגוון ביותר. סיווג רחב זה הביא לסיווג מחדש של הסוג, והציג 23 סוגים חדשים בשנת 20202.
הסוג הוותיק והרחב יותר כלל זנים עיקריים של קומנסל ופרוביוטיקה הנחשבים בדרך כלל בטוחים לצריכה (GRAS)3. משפחת Lactobacillaceae שומרת על תפיסה ציבורית של היותם “חיידקים טובים” בשל היתרונות הבריאותיים המדווחים הרבים המוענקים באמצעות צריכת זנים שונים 4,5,6,7. הקלות שבה הם יכולים לנווט במערכת העיכול8 וקבלתם הציבורית משתלבים יחד כדי למצב את זני Lactobacillaceae כמועמדים חזקים כמו אורגניזמים שלדה ליישומים רפואיים, טיפוליים או אבחוניים הניתנים לבליעה.
המגוון הרחב של המאפיינים הקיימים במשפחת Lactobacillaceae הוביל למצב שבו אין זן מודל אורגניזם דה פקטו; קבוצות מחקר נטו לבחור מינים בעלי התכונות הרלוונטיות ביותר למטרותיהם הספציפיות. (לדוגמה, מעבדות תסיסה של מוצרי חלב יכולות לבחור ב-L. lactis; מחקרים על תסיסה צמחית עשויים לבחור ב-L. plantarum; מחקר על פרוביוטיקה עשוי להתמקד ב-L. acidophilus; וכן הלאה.)
אותו מגוון רחב של מאפיינים בין מינים שונים הוביל להצטברות של פרוטוקולים ופרוצדורות שעשויים לעבוד היטב עבור תת-קבוצה אחת של משפחת Lactobacillaceae , אך דורשים אופטימיזציה כדי לעבוד ביעילות (או אולי לתפקד בכלל) באחרים9. הצורך הזה באופטימיזציה בין בני משפחה ואפילו בתוך בני אותו מין יכול לסכל את מאמציהם של חוקרים לא מוכרים. פרוטוקולים המתפרסמים במדורי השיטות של מאמרים יכולים לכלול גם שינויים משלהם10, מה שמוביל לאוספי פרוטוקולים מקוטעים ומבוזרים.
L. reuteri נחשב לקומנסל נפוץ של בעלי חוליות, ונמצא באופן עקבי ביונקים, עופות11 ודגים12 במערכת העיכול (GI). תת-זנים של L. reuteri מתמחים לעתים קרובות גנטית, באמצעות הסתגלות חלבון הידבקות ריר, כדי ליישב באופן קבוע יותר פונדקאים מקומיים ספציפיים 8,11,13. מיני Limosilactobacillus במערכת העיכול יכולים להיות מבודדים בפונדקאים מחוץ לפונדקאי המקומי שלהם, אך נוטים יותר לטבע חולף8.
בשל התמחות האדם-מארח, L. reuteri DSM20016 ממצב את עצמו היטב כמארז ליישומים אבחוניים או טיפוליים בכל נקודה במערכת העיכול האנושית, והמאמץ DSM20016 יכול לספק חלון השפעה ארוך טווח יותר להתערבויות בהשוואה לזנים חולפים יותר.
במאמר זה, אנו מתארים סדרה של פרוטוקולים עם יעילות מוכחת ב- Limosilactobacillus reuteri (ייעוד זן: F275; מספרי איסוף אחרים: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), יחד עם מידע מרוכז על הזן ממקורות אחרים כדי לסייע ביישומים ביולוגיים מולקולריים ומערכתיים. הנהלים המפורטים כאן צריכים לאפשר לחוקר ללא ניסיון קודם לתרבית L. reuteri, ליצור מלאי אלקטרוכשיר, לבחור מושבות מותמרות, לאשר טרנספורמציה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז מושבה (PCR), ולמדוד תגובת מערכת מתוכננת באמצעות חלבוני כתב פלואורסצנטי.
נציין כי פרוטוקולים קשורים כיסו רקומבינציה מחדש של גנום SSDNA בסיוע CRISPR-Cas9 ב- L. reuteri (זן: ATCC-PTA-6475)14, ועריכת גנום בסיוע CRSIPR-Cas9 nickase במספר רב שאינו L. ראוטרי, Lactobacillaceae משפחה כתמים15,16; עם זאת, אלה אינם מתייחסים לזן L. reuteri DSM20016 שבו אנו מתמקדים כאן.
השלב הקריטי ביותר לשינוי של L. reuteri DSM20016 הוא יצירת תנאי צמיחה אנאירוביים לאחר טרנספורמציות מצופות; מושבות שנרכשות בתנאים אירוביים הן רק מזדמנות מאוד ובדרך כלל אינן מצליחות לגדול כאשר מחוסנים במרק MRS. יש לתרגל גם ציפוי של כל נפח ההתאוששות כדי למקסם את ההסתברות לצמיחת מושבה. אפילו עם שני …
The authors have nothing to disclose.
אנו מעריכים מאוד את עצתו רבת הערך של פרופ’ J.P. van Pijkeren (אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון), שהדרכתו בעבודה עם L. reuteri ATCC PTA 6475 סיפקה בסיס לשיטות המתוארות כאן.
1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
Agarose | BioShop | AGR001 | |
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
Glycerol | BioShop | GLY001 | |
Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
Sucrose | BioShop | SUC507 | |
TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |