שיטות לאלקטרופורציה ואישור טרנספורמציה ב- Limosilactobacillus reuteri DSM20016
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לעבודה עם Limosilactobacillus reuteri DSM20016, המפרטים צמיחה, טרנספורמציה פלסמיד, PCR מושבה, מדידת חלבון מדווח פלואורסצנטי, ומיני הכנת פלסמיד מוגבלת, כמו גם בעיות נפוצות ופתרון בעיות. פרוטוקולים אלה מאפשרים מדידה של חלבוני כתב DSM20016, או אישור באמצעות PCR מושבה אם אין מדווח מעורב.
Abstract
לקטובצילוס היה סוג גדול ומגוון להפליא של חיידקים שכלל 261 מינים, כמה מהם זנים קומנסליים עם פוטנציאל לשימוש כמארז למאמצים ביולוגיים סינתטיים במערכת העיכול. השונות הפנוטיפית והגנוטיפית הרחבה שנצפתה בתוך הסוג הובילה לאחרונה לסיווג מחדש ולהכנסת 23 סוגים חדשים.
בשל רוחב הווריאציות בתוך הז’אנר הישן, פרוטוקולים שהודגמו בחבר אחד עשויים שלא לעבוד כפי שפורסם עם חברים אחרים. מחסור במידע מרוכז על איך בדיוק לתפעל זנים ספציפיים הוביל למגוון גישות אד-הוק , שלעתים קרובות מותאמות ממשפחות חיידקים אחרות. זה יכול לסבך את העניינים עבור חוקרים מתחילים בתחום, שאולי לא יודעים איזה מידע חל או לא חל על הזן הנבחר שלהם.
במאמר זה, אנו שואפים לרכז סדרה של פרוטוקולים עם הצלחה מוכחת, במיוחד בכינוי זן Limosilactobacillus reuteri F275 (מספרי איסוף אחרים: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), יחד עם ייעוץ לפתרון בעיות ובעיות נפוצות שאדם עשוי להיתקל בהן. פרוטוקולים אלה אמורים לאפשר לחוקר עם ניסיון מועט, אם בכלל, בעבודה עם L. reuteri DSM20016 לשנות פלסמיד, לאשר טרנספורמציה ולמדוד משוב מערכת בקורא צלחות באמצעות חלבון כתב.
Introduction
הסוג לקטובצילוס סווג היסטורית כגראם-חיובי, בצורת מוט, שאינו יוצר נבגים, אנארובים פקולטטיביים או מיקרו-אירופילים המפרקים סוכרים לייצור חומצה לקטית1. קריטריונים רופפים אלה הובילו לכך שלקטובצילוס היה, מבחינה פנוטיפית וגנוטיפית, סוג מגוון ביותר. סיווג רחב זה הביא לסיווג מחדש של הסוג, והציג 23 סוגים חדשים בשנת 20202.
הסוג הוותיק והרחב יותר כלל זנים עיקריים של קומנסל ופרוביוטיקה הנחשבים בדרך כלל בטוחים לצריכה (GRAS)3. משפחת Lactobacillaceae שומרת על תפיסה ציבורית של היותם “חיידקים טובים” בשל היתרונות הבריאותיים המדווחים הרבים המוענקים באמצעות צריכת זנים שונים 4,5,6,7. הקלות שבה הם יכולים לנווט במערכת העיכול8 וקבלתם הציבורית משתלבים יחד כדי למצב את זני Lactobacillaceae כמועמדים חזקים כמו אורגניזמים שלדה ליישומים רפואיים, טיפוליים או אבחוניים הניתנים לבליעה.
המגוון הרחב של המאפיינים הקיימים במשפחת Lactobacillaceae הוביל למצב שבו אין זן מודל אורגניזם דה פקטו; קבוצות מחקר נטו לבחור מינים בעלי התכונות הרלוונטיות ביותר למטרותיהם הספציפיות. (לדוגמה, מעבדות תסיסה של מוצרי חלב יכולות לבחור ב-L. lactis; מחקרים על תסיסה צמחית עשויים לבחור ב-L. plantarum; מחקר על פרוביוטיקה עשוי להתמקד ב-L. acidophilus; וכן הלאה.)
אותו מגוון רחב של מאפיינים בין מינים שונים הוביל להצטברות של פרוטוקולים ופרוצדורות שעשויים לעבוד היטב עבור תת-קבוצה אחת של משפחת Lactobacillaceae , אך דורשים אופטימיזציה כדי לעבוד ביעילות (או אולי לתפקד בכלל) באחרים9. הצורך הזה באופטימיזציה בין בני משפחה ואפילו בתוך בני אותו מין יכול לסכל את מאמציהם של חוקרים לא מוכרים. פרוטוקולים המתפרסמים במדורי השיטות של מאמרים יכולים לכלול גם שינויים משלהם10, מה שמוביל לאוספי פרוטוקולים מקוטעים ומבוזרים.
L. reuteri נחשב לקומנסל נפוץ של בעלי חוליות, ונמצא באופן עקבי ביונקים, עופות11 ודגים12 במערכת העיכול (GI). תת-זנים של L. reuteri מתמחים לעתים קרובות גנטית, באמצעות הסתגלות חלבון הידבקות ריר, כדי ליישב באופן קבוע יותר פונדקאים מקומיים ספציפיים 8,11,13. מיני Limosilactobacillus במערכת העיכול יכולים להיות מבודדים בפונדקאים מחוץ לפונדקאי המקומי שלהם, אך נוטים יותר לטבע חולף8.
בשל התמחות האדם-מארח, L. reuteri DSM20016 ממצב את עצמו היטב כמארז ליישומים אבחוניים או טיפוליים בכל נקודה במערכת העיכול האנושית, והמאמץ DSM20016 יכול לספק חלון השפעה ארוך טווח יותר להתערבויות בהשוואה לזנים חולפים יותר.
במאמר זה, אנו מתארים סדרה של פרוטוקולים עם יעילות מוכחת ב- Limosilactobacillus reuteri (ייעוד זן: F275; מספרי איסוף אחרים: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), יחד עם מידע מרוכז על הזן ממקורות אחרים כדי לסייע ביישומים ביולוגיים מולקולריים ומערכתיים. הנהלים המפורטים כאן צריכים לאפשר לחוקר ללא ניסיון קודם לתרבית L. reuteri, ליצור מלאי אלקטרוכשיר, לבחור מושבות מותמרות, לאשר טרנספורמציה באמצעות תגובת שרשרת פולימראז מושבה (PCR), ולמדוד תגובת מערכת מתוכננת באמצעות חלבוני כתב פלואורסצנטי.
נציין כי פרוטוקולים קשורים כיסו רקומבינציה מחדש של גנום SSDNA בסיוע CRISPR-Cas9 ב- L. reuteri (זן: ATCC-PTA-6475)14, ועריכת גנום בסיוע CRSIPR-Cas9 nickase במספר רב שאינו L. ראוטרי, Lactobacillaceae משפחה כתמים15,16; עם זאת, אלה אינם מתייחסים לזן L. reuteri DSM20016 שבו אנו מתמקדים כאן.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלב הקריטי ביותר לשינוי של L. reuteri DSM20016 הוא יצירת תנאי צמיחה אנאירוביים לאחר טרנספורמציות מצופות; מושבות שנרכשות בתנאים אירוביים הן רק מזדמנות מאוד ובדרך כלל אינן מצליחות לגדול כאשר מחוסנים במרק MRS. יש לתרגל גם ציפוי של כל נפח ההתאוששות כדי למקסם את ההסתברות לצמיחת מושבה. אפילו עם שני …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מעריכים מאוד את עצתו רבת הערך של פרופ’ J.P. van Pijkeren (אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון), שהדרכתו בעבודה עם L. reuteri ATCC PTA 6475 סיפקה בסיס לשיטות המתוארות כאן.
Materials
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
| Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
| Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
| MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
| Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
| pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
| VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
References
- Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
- Zheng, J., et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (4), 2782-2858 (2020).
- Adams, M. R., Marteau, P. On the safety of lactic acid bacteria from food. International Journal of Food Microbiology. 27 (2-3), 263-264 (1995).
- Urbańska, M., Gieruszczak-Białek, D., Szajewska, H. Systematic review with meta-analysis: Lactobacillus reuteri DSM 17938 for diarrhoeal diseases in children. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (10), 1025-1034 (2016).
- Jansson, P. A., et al. Probiotic treatment using a mix of three Lactobacillus strains for lumbar spine bone loss in postmenopausal women: a randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre trial. The Lancet Rheumatology. 1 (3), e154-e162 (2019).
- Yang, C., et al. Effects of non-viable Lactobacillus reuteri combining with 14-day standard triple therapy on Helicobacterpylori eradication: A randomized double-blind placebo-controlled trial. Helicobacter. 26 (6), 12856 (2021).
- Nikawa, H., et al. Lactobacillus reuteri in bovine milk fermented decreases the oral carriage of mutans streptococci. International Journal of Food Microbiology. 95 (2), 219-223 (2004).
- Reuter, G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology. 2 (2), 43-53 (2001).
- Aukrust, T. W., Brurberg, M. B., Nes, I. F. Transformation of Lactobacillus by electroporation. Methods in Molecular Biology. 47, 201-208 (1995).
- Lubkowicz, D., et al. Reprogramming probiotic Lactobacillus reuteri as a biosensor for Staphylococcus aureus derived AIP-I detection. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1229-1237 (2018).
- Walter, J., Britton, R. A., Roos, S. Host-microbial symbiosis in the vertebrate gastrointestinal tract and the Lactobacillus reuteri paradigm. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 4645-4652 (2011).
- Ahmad, W., et al. Production of bimodal molecular weight levan by a Lactobacillus reuteri isolate from fish gut. Folia Microbiologica. 67 (1), 21-31 (2022).
- MacKenzie, D. A., et al. Strain-specific diversity of mucus-binding proteins in the adhesion and aggregation properties of Lactobacillus reuteri. Microbiology. 156 (11), 3368-3378 (2010).
- Oh, J. H., van Pijkeren, J. P. CRISPR-Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri. Nucleic Acids Research. 42 (17), 131 (2014).
- Song, X., Huang, H., Xiong, Z., Ai, L., Yang, S. CRISPR-Cas9D10A nickase-assisted genome editing in Lactobacillus casei. Applied and Environmental Microbiology. 83 (22), e01259 (2017).
- Goh, Y. J., Barrangoua, R. Portable CRISPR-Cas9N system for flexible genome engineering in Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus paracasei. Applied and Environmental Microbiology. 87 (6), e02669 (2021).
- Berthier, F., Zagorec, M., Champomier-Verg, M., Ehrlich, S. D., Morel-Devillel, F. Efficient transformation of Lactobacillus sake by electroporation. Microbiology. 142 (5), 1273-1279 (1996).
- Rattanachaikunsopon, P., Phumkhachorn, P. Glass bead transformation method for gram-positive bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 40 (4), 923 (2009).
- Pflügl, S., Marx, H., Mattanovich, D., Sauer, M. Genetic engineering of Lactobacillus diolivorans. FEMS Microbiology Letters. 344 (2), 152-158 (2013).
- Spath, K., Heinl, S., Grabherr, R. Direct cloning in Lactobacillus plantarum: Electroporation with non-methylated plasmid DNA enhances transformation efficiency and makes shuttle vectors obsolete. Microbial Cell Factories. 11, 141 (2012).
- Ortiz-Velez, L., et al. Genome alterations associated with improved transformation efficiency in Lactobacillus reuteri. Microbial Cell Factories. 17 (1), 138 (2018).
- O’Sullivan, D. J., Klaenhammer, T. R. Rapid mini-prep isolation of high-quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2730-2733 (1993).
- Lizier, M., Sarra, P. G., Cauda, R., Lucchini, F. Comparison of expression vectors in Lactobacillus reuteri strains. FEMS Microbiology Letters. 308 (1), 8-15 (2010).
- Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: Enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Research. 43, D298-D299 (2015).
- Ahrne, S., Molin, G., Axelsson, L. Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation: Studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631. Current Microbiology. 24, 199-205 (1992).
