リ モシラクトバチルス・ロイテリ におけるエレクトロポレーションと形質転換確認の方法 DSM20016
Summary
ここでは、 Limosilactobacillus reuteri DSM20016を使用するためのプロトコル、増殖、プラスミド形質転換、コロニーPCR、蛍光レポータータンパク質測定、および限定的なプラスミドミニプレップ、および一般的な問題とトラブルシューティングについて詳しく説明します。これらのプロトコルにより、DSM20016中のレポータータンパク質の測定、またはレポーターが関与しない場合はコロニーPCR による 確認が可能になります。
Abstract
Lactobacillus は、261種からなる信じられないほど大きく多様な細菌属であり、そのうちのいくつかは、胃腸管内の合成生物学的努力のシャーシとして使用する可能性のある共生株でした。属内で観察された幅広い表現型と遺伝子型の多様性は、最近の再分類と23の新規属の導入につながりました。
古い属内のバリエーションの幅が広いため、あるメンバーで示されたプロトコルは、他のメンバーと宣伝されているように機能しない場合があります。特定の菌株を正確に操作する方法に関する一元化された情報の欠如は、しばしば他の細菌ファミリーから適応されたさまざまな アドホック アプローチにつながりました。これは、どの情報が選択した株に適用されるか、または適用されないかを知らない可能性のある、この分野に参入する研究者にとって問題を複雑にする可能性があります。
この論文では、特に Limosilactobacillus reuteri 株指定F275(その他のコレクション番号:DSM20016、ATCC23272、CIP109823)で、成功が実証された一連のプロトコルを、トラブルシューティングのアドバイスと発生する可能性のある一般的な問題とともに一元化することを目指しています。これらのプロトコルにより、 L. reuteri DSM20016を使用した経験がほとんどまたはまったくない研究者でも、プラスミドの形質転換、形質転換の確認、およびレポータータンパク質 を介した プレートリーダーでのシステムフィードバックの測定が可能になります。
Introduction
ラクトバチルス属は歴史的に、グラム陽性、棒状、非胞子形成、通性嫌気性菌または糖を分解して主に乳酸を生成する微好気性菌のいずれかに分類されていました1。これらの緩い基準により、ラクトバチルスは表現型的にも遺伝子型的にも非常に多様な属になりました。この大まかな分類により、属は再分類され、2020年に23の新規属が導入されました2。
古くてより広い属には、一般的に消費に安全であると考えられている主要な共生種とプロバイオティクス種(GRAS)が含まれていました3。乳酸菌科は、さまざまな菌株の消費によってもたらされる多くの報告された健康上の利点により、「善玉菌」であるという一般の認識を維持しています4,5,6,7。彼らが胃腸管をナビゲートできることの容易さ8と彼らの一般の受け入れは、Lactobacillaceae株を摂取可能な薬用、治療、または診断アプリケーションのためのシャーシ生物としての強力な候補として位置付けるために組み合わされます。
ラクトバチルス科内に存在する幅広い特性は、事実上のモデル生物株が存在しない状況につながっています。研究グループは、特定の目的に最も関連する特性を持つ種を選択する傾向がありました。(例えば、酪農発酵ラボでは L. lactis、野菜発酵の研究では L. plantarum 、プロバイオティクスの研究では L. acidophilus などが考えられます。
種間のこの同じ幅広い特性は、 Lactobacillaceae科 の1つのサブセットではうまく機能するかもしれないが、他のサブセットで効率的に機能するために(またはおそらくまったく機能するために)最適化を必要とするプロトコルと手順の蓄積につながりました9。家族間、そして同じ種のメンバー内でさえも最適化のこの必要性は、なじみのない研究者の努力を挫折させる可能性があります。論文のメソッドセクションに掲載されたプロトコルは、それら自身の修正10を含むこともでき、断片化された分散型プロトコルコレクションにつながる。
L. reuteriは広く脊椎動物の共生動物と考えられており、哺乳類、鳥類11および魚類12の胃腸(GI)管で一貫して見られます。L. reuteri亜株は、粘液接着タンパク質の適応を介して、特定の天然宿主により恒久的にコロニーを形成するために遺伝的に特殊化されることがよくあります8,11,13。消化管リモシラクトバチルス種は、天然宿主以外の宿主で分離することができますが、一過性の性質に向かう傾向があります8。
ヒトと宿主の特殊化により、 L. reuteri DSM20016は、ヒト消化管の任意の時点で診断または治療アプリケーションのためのシャーシとしての地位を非常によく位置付けており、より一時的な株と比較して、DSM20016株は介入の効果のより長い持続性ウィンドウを提供する可能性があります。
この論文では、 Limosilactobacillus reuteri (菌株名:F275、その他の収集番号:DSM20016、ATCC23272、CIP109823)で有効性が実証された一連のプロトコルの概要と、分子生物学およびシステム生物学のアプリケーションを支援するために、他のソースからの菌株に関する一元化された情報について説明します。ここに記載されている手順は、 L. reuteriの培養、電気コンピテントストックの作成、形質転換コロニーの選択、コロニーポリメラーゼ連鎖反応(PCR) による 形質転換の確認、および蛍光レポータータンパク質 を介した 設計されたシステム応答の測定を可能にするはずです。
関連するプロトコルは、L. reuteri (株: ATCC-PTA-6475)14 における CRISPR-Cas9 支援 ssDNA ゲノム再構成、および複数の非 L. ロイテリにおける CRSIPR-Cas9 ニッカーゼ支援ゲノム編集をカバーしていることに注目する。 ロイテリ、ラクトバチルス科の染色15,16;ただし、これらは、ここで焦点を当てているL.ロイテリDSM20016株には対応していません。
Protocol
Representative Results
Discussion
L. reuteri DSM20016の形質転換のための最も重要なステップは、形質転換がプレーティングされた後の嫌気性増殖条件の生成である。好気性条件で得られたコロニーはごくまれにしかなく、MRSブロスに接種すると一般に成長しません。コロニーの成長の可能性を最大化するために、回収量全体をプレーティングすることも実施する必要があります。これらの2つの重要なステップがあっても?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.P. van Pijkeren教授(ウィスコンシン大学マディソン校)の貴重なアドバイスには、 L. reuteri ATCC PTA 6475との連携に関するガイダンスが、ここで説明する方法の基礎を提供してくれたことに大いに感謝しています。
Materials
| 1 kb Plus DNA Ladder | NEB | N3200L | |
| 1mL Spectrophotometer cuvettes | Thomas Scientific | 1145J12 | |
| Agarose | BioShop | AGR001 | |
| Allegra X-15R (refrigerated centrifuge) | Beckman Allegra | N/A | No longer in production |
| AnaeroGen 2.5 L Sachet | Thermo Scientific | OXAN0025A | |
| BTX, ECM 399 electroporation system | VWR | 58017-984 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | FroggaBio | TB50-500 | |
| DNA gel x6 loading dye | NEB | B7024S | |
| Electroporation cuvette | Fisherbrand | FB101 | |
| Erythromycin | Millipore Sigma | E5389-5G | |
| Gel electroporation bath/dock | VWR | 76314-748 | |
| Glycerol | BioShop | GLY001 | |
| Limosilactobacillus reuteri | Leibniz Institute DSMZ | DSM20016 | Strain designation F275 |
| Lysozyme | BioShop | LYS702.5 | |
| Microcentrifuge tubes (1.7 mL) | FroggaBio | LMCT1.7B | |
| Miniprep kit (Qiagen) | Qiagen | 27106 | slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein |
| MRS Broth (Dehydrated) | Thermo Scientific | CM0359B | |
| Mutanolysin | Millipore Sigma | M9901-5KU | |
| NaOH | Millipore Sigma | 1064691000 | |
| P100 Pipette | Eppendorf | 3123000047 | |
| P1000 Pipette | Eppendorf | 3123000063 | |
| P2.5 Pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| P20 Pipette | Eppendorf | 3123000039 | |
| P200 Pipette | Eppendorf | 3123000055 | |
| PCR tubes | FroggaBio | STF-A120S | |
| Personal benchtop microcentrifuge | Genlantis | E200100 | |
| Petri dishes | VWR | 25384-088 | |
| PTC-150 Thermal Cycler | MJ Research | N/A | No longer in production |
| pTRKH3_slpGFP (modified) | Addgene | 27168 | |
| SPECTRONIC 200 Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-281700 | |
| Storage microplate | Fisher Scientific | 14-222-225 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| TAE Buffer 50x | Thermo Scientific | B49 | |
| Vortex | VWR | 58816-121 | No longer in production |
| VWR 1500E incubator | VWR | N/A | No longer in production |
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