Alineación de datos sincronizados de series temporales utilizando el modelo de caracterización de la pérdida de sincronía del ciclo celular para comparaciones entre experimentos
Summary
Un desafío de analizar experimentos sincronizados de series de tiempo es que los experimentos a menudo difieren en la duración de la recuperación de la sincronía y el período del ciclo celular. Por lo tanto, las mediciones de diferentes experimentos no pueden analizarse en conjunto o compararse fácilmente. Aquí, describimos un método para alinear experimentos para permitir comparaciones específicas de fase.
Abstract
La investigación del ciclo celular a menudo depende de la sincronización de las poblaciones celulares para medir varios parámetros en una serie de tiempo a medida que las células atraviesan el ciclo celular. Sin embargo, incluso en condiciones similares, los experimentos replicados muestran diferencias en el tiempo requerido para recuperarse de la sincronía y atravesar el ciclo celular, evitando así las comparaciones directas en cada punto de tiempo. El problema de comparar mediciones dinámicas entre experimentos se exacerba en poblaciones mutantes o en condiciones de crecimiento alternativas que afectan el tiempo de recuperación de sincronía y / o el período del ciclo celular.
Hemos publicado previamente un modelo matemático paramétrico llamado Caracterización de la pérdida de sincronía del ciclo celular (CLOCCS) que monitorea cómo las poblaciones sincrónicas de células se liberan de la sincronía y progresan a través del ciclo celular. Los parámetros aprendidos del modelo se pueden usar para convertir puntos de tiempo experimentales de experimentos sincronizados de series temporales en una escala de tiempo normalizada (puntos de línea de vida). En lugar de representar el tiempo transcurrido en minutos desde el inicio del experimento, la escala de línea de vida representa la progresión desde la sincronía hasta la entrada del ciclo celular y luego a través de las fases del ciclo celular. Dado que los puntos de la línea de vida corresponden a la fase de la célula promedio dentro de la población sincronizada, esta escala de tiempo normalizada permite comparaciones directas entre experimentos, incluidos aquellos con períodos y tiempos de recuperación variables. Además, el modelo se ha utilizado para alinear experimentos de ciclo celular entre diferentes especies (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe), permitiendo así la comparación directa de las mediciones del ciclo celular, que pueden revelar similitudes y diferencias evolutivas.
Introduction
Las mediciones de series temporales realizadas en poblaciones sincronizadas de células a medida que progresan a través del ciclo celular es un método estándar para investigar los mecanismos que controlan la progresión del ciclo celular 1,2,3,4,5,6,7,8 . La capacidad de hacer comparaciones entre experimentos de series temporales de sincronía / lanzamiento es vital para nuestra comprensión de estos procesos dinámicos. El uso de experimentos replicados para corroborar los hallazgos puede aumentar la confianza en la reproducibilidad de las conclusiones. Además, las comparaciones entre las condiciones ambientales, entre mutantes e incluso entre especies pueden descubrir muchos nuevos conocimientos sobre la regulación del ciclo celular. Sin embargo, la variabilidad interexperimental en la recuperación de la sincronía y en la velocidad de la progresión del ciclo celular afecta la capacidad de hacer comparaciones de punto a punto de tiempo entre réplicas o entre experimentos con tiempo alterado del ciclo celular. Debido a estos desafíos, las réplicas a menudo no se incluyen para la serie de tiempo completo (por ejemplo, Spellman et al.4). Cuando se recopilan réplicas para toda la serie temporal, los datos no se pueden analizar en conjunto, sino que se utiliza una sola réplica para el análisis, y otras réplicas a menudo se relegan a cifras suplementarias (por ejemplo, Orlando et al.8). Además, las comparaciones entre experimentos con diferentes características de recuperación o progresión del ciclo celular son difíciles. Las mediciones de intervalos más pequeños entre un evento de interés y un punto de referencia del ciclo celular (por ejemplo, emergencia de brotes, entrada en fase S o inicio en anafase) pueden ayudar a reducir los errores si se realiza un seguimiento de estos eventos de referencia 1,2,3,9,10,11,12. Sin embargo, las diferencias sutiles pero importantes pueden permanecer sin ser detectadas u ocultas utilizando estos métodos ad hoc. Finalmente, los análisis de células individuales permiten analizar la progresión del ciclo celular sin depender de la sincronización o la alineación13, aunque las mediciones a gran escala en estudios de células individuales pueden ser desafiantes y costosas.
Para superar estas dificultades, desarrollamos el modelo Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) para ayudar al análisis de las mediciones de series temporales realizadas en poblaciones sincronizadas14,15. CLOCCS es un modelo matemático flexible que describe la distribución de células sincronizadas a través de las fases del ciclo celular a medida que se liberan de la sincronía y progresan a través del ciclo celular. El marco del proceso de ramificación permite que el modelo tenga en cuenta las cualidades asimétricas de las células madre e hija después de la división, como se observa en S. cerevisiae, sin dejar de ser útil para organismos que se dividen por fisión, como S. pombe. El modelo puede tomar entradas de un conjunto diverso de tipos de medición para especificar la fase del ciclo celular. Puede ingerir datos de fase del ciclo celular en ciernes, que incluyen mediciones del porcentaje de células gemadas a lo largo del tiempo, lo que permite la estimación del número de células fuera de la fase G1 no brotada14,15. El modelo también puede ingerir datos citométricos de flujo que miden el contenido de ADN, lo que permite la evaluación de transiciones históricas de G1 a S, S a G2 y M a G115. Los marcadores morfológicos fluorescentes también se pueden utilizar para identificar la fase del ciclo celular. El marcado fluorescente de los anillos, núcleos y cuerpos de polo fusiforme (SPB) de miosina se puede utilizar para determinar la fase del ciclo celular, y estos se incorporaron al modeloCLOCCS 11; Sin embargo, estas mediciones no se describirán en este protocolo. Además, el índice de septación se utilizó como entrada para modelar datos de S. pombe14. Por lo tanto, el modelo se puede utilizar para análisis del ciclo celular en una variedad de organismos y se puede ampliar aún más.
CLOCCS es un modelo paramétrico que permite la inferencia bayesiana completa de múltiples parámetros a partir de los datos de entrada (por ejemplo, porcentaje de gemación, contenido de ADN). Estos parámetros incluyen el tiempo de recuperación de la sincronía, la duración del período del ciclo celular (estimado por separado para las células madre e hija) y la posición promedio del ciclo celular de las células en cada punto de tiempo. Estos parámetros representan el comportamiento de la célula promedio en la población, lo que permite al investigador mapear cada punto de tiempo a una posición del ciclo celular expresada como un punto de línea de vida. La conversión a puntos de línea de vida depende de los parámetros lambda (λ) y mu0 (μ0)14,15 de CLOCCS. El parámetro λ corresponde al período promedio del ciclo celular de las células madre. Sin embargo, debido al retraso madre-hija14,15, este no es el período promedio del ciclo celular de toda la población que incluye tanto las células madre como hija. CLOCCS también infiere el parámetro delta (δ), que corresponde al retraso madre-hija y, por lo tanto, permite el cálculo del período promedio del ciclo celular de toda la población. Finalmente, debido a que cada experimento comienza después de la liberación de la sincronización del ciclo celular, el tiempo requerido para recuperarse del método de sincronización se representa mediante el parámetro CLOCCS μ0. CLOCCS ajusta un modelo a los datos de fase del ciclo celular de entrada y luego infiere estos parámetros utilizando un algoritmo de Monte Carlo de cadena de Markov aleatorio14,15. Al mapear múltiples experimentos a una escala de tiempo común de la línea de vida del ciclo celular, se pueden hacer comparaciones directas específicas de fase entre réplicas o experimentos donde el tiempo de recuperación o los períodos del ciclo celular no son idénticos 8,14,15.
Como las poblaciones sincronizadas pierden sincronía a cierto ritmo en el transcurso de la serie temporal14,15,16,17, la variabilidad en la tasa de pérdida de sincronía también puede impedir las comparaciones cuantitativas entre experimentos. Al identificar la ubicación de las poblaciones y la varianza en sus distribuciones, CLOCCS explica las diferencias en las tasas de pérdida de sincronía. Esta poderosa herramienta permite comparaciones específicas y detalladas entre experimentos, proporcionando así la capacidad de hacer directamente comparaciones relevantes no solo entre réplicas sino también entre condiciones ambientales, mutantes e incluso especies que tienen un tiempo de ciclo celular dramáticamente diferente14,15.
Este documento describe un método que utiliza CLOCCS para estimar parámetros ajustando datos de experimentos de series temporales de sincronía / liberación, mapear los datos a una escala de línea de vida común y luego hacer comparaciones relevantes entre réplicas o experimentos. La alineación de la línea de vida permite comparaciones directas específicas de fase a través de estos experimentos, lo que permite la agregación y comparación de réplicas y para hacer comparaciones más relevantes entre experimentos con diferentes tiempos de recuperación y períodos de ciclo celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artículo presenta un método para evaluar de manera más precisa y cuantitativa los datos de experimentos de series temporales en poblaciones sincronizadas de células. El método utiliza parámetros aprendidos de CLOCCS, un modelo de inferencia bayesiana que utiliza datos de fase del ciclo celular de entrada, como datos de gemación y datos de contenido de ADN por citometría de flujo, para parametrizar cada experimento14,15. CLOCCS utiliza los datos de fa…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. Campione y S. Haase fueron apoyados por fondos de la National Science Foundation (DMS-1839288) y los Institutos Nacionales de Salud (5R01GM126555). Además, los autores desean agradecer a Huarui Zhou (Universidad de Duke) por los comentarios sobre el manuscrito y por las pruebas beta del protocolo. También agradecemos a Francis Motta (Florida Atlantic University) y Joshua Robinson por su ayuda con el código Java.
Materials
| 2x PBS | For Fixative Solution. Described in Leman 2014. | ||
| 4% formaldehyde | For Fixative Solution. | ||
| 100% Ethanol | For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002. | ||
| CLOCCS | https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git | ||
| Flow Cytometer | For flow cytometry protocol. | ||
| Git | https://git-scm.com/ | ||
| Java 19 | https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19 | ||
| Microscope | For counting cells and buds. | ||
| Miniconda | https://docs.conda.io/en/latest/ | ||
| Protease solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| RNAse A solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | For flow cytometry staining. Described in Haase 2002. |
| Tris | pH 7.5 |
Referências
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