교차 실험 비교를 위한 세포 주기 동기화 모델의 특성화 손실을 사용한 동기화된 시계열 데이터의 정렬
Summary
동기화된 시계열 실험 분석의 한 가지 과제는 실험이 종종 동기 및 세포 주기 기간으로부터의 회복 기간이 다르다는 것입니다. 따라서 서로 다른 실험의 측정값을 집계하여 분석하거나 쉽게 비교할 수 없습니다. 여기에서는 단계별 비교가 가능하도록 실험을 정렬하는 방법을 설명합니다.
Abstract
세포 주기를 조사하는 것은 종종 세포가 세포 주기를 통과할 때 시계열로 다양한 매개변수를 측정하기 위해 세포 집단을 동기화하는 데 달려 있습니다. 그러나 유사한 조건에서도 반복 실험은 동기화에서 회복하고 세포 주기를 통과하는 데 필요한 시간의 차이를 나타내므로 각 시점에서 직접적인 비교가 불가능합니다. 실험 전반에 걸쳐 동적 측정을 비교하는 문제는 돌연변이 집단 또는 동기 회복 시간 및/또는 세포 주기 기간에 영향을 미치는 대체 성장 조건에서 악화됩니다.
우리는 이전에 세포의 동기 집단이 동기화에서 방출되고 세포 주기를 통해 진행되는 방식을 모니터링하는 CLOCCS(Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony)라는 파라메트릭 수학적 모델을 발표했습니다. 그런 다음 모델에서 학습된 매개 변수를 사용하여 동기화된 시계열 실험의 실험 시점을 정규화된 시간 척도(라이프라인 포인트)로 변환할 수 있습니다. lifeline scale은 실험 시작부터 경과 시간을 분 단위로 나타내는 대신 동기에서 세포 주기 진입까지의 진행을 나타내며 그 다음에는 세포 주기의 단계를 거칩니다. 라이프라인 포인트는 동기화된 모집단 내의 평균 세포 위상에 해당하기 때문에 이 정규화된 시간 척도를 통해 다양한 기간과 회복 시간을 가진 실험을 포함하여 실험 간에 직접 비교할 수 있습니다. 또한, 이 모델은 서로 다른 종(예: Saccharomyces cerevisiae 및 Schizosaccharomyces pombe) 간의 세포 주기 실험을 정렬하는 데 사용되어 세포 주기 측정을 직접 비교할 수 있어 진화적 유사점과 차이점을 밝힐 수 있습니다.
Introduction
세포주기가 진행됨에 따라 동기화된 세포 집단에 대한 시계열 측정은 세포주기 진행을 제어하는 메커니즘을 조사하기 위한 표준 방법입니다 1,2,3,4,5,6,7,8 . 동시성/릴리스 시계열 실험을 비교하는 기능은 이러한 동적 프로세스를 이해하는 데 매우 중요합니다. 결과를 확증하기 위해 반복 실험을 사용하면 결론의 재현성에 대한 신뢰도를 높일 수 있습니다. 또한 환경 조건, 돌연변이 간, 심지어 종 간의 비교를 통해 세포주기 조절에 대한 많은 새로운 통찰력을 발견 할 수 있습니다. 그러나 동시성으로부터의 회복 및 세포 주기 진행 속도의 실험 간 가변성은 복제물 간 또는 변경된 세포 주기 타이밍이 있는 실험 간에 시점 간 비교를 수행하는 능력을 손상시킵니다. 이러한 문제로 인해, 반복실험은 종종 전체 시계열(예: Spellman et al.4)에 포함되지 않습니다. 전체 시계열의 반복실험이 수집되면 데이터를 집계하여 분석할 수 없고 단일 반복이 분석에 사용되며 다른 반복실험은 종종 보충 수치로 강등됩니다(예: Orlando et al.8). 또한, 상이한 회복 또는 세포주기 진행 특성을 가진 실험 간의 비교는 어렵다. 관심 있는 사건과 세포 주기 랜드마크(예: 새싹 출현, S상 진입 또는 아나페이즈 시작) 사이의 더 작은 간격을 측정하면 이러한 랜드마크 이벤트를 추적하는 경우 오류를 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다 1,2,3,9,10,11,12. 그러나 미묘하지만 중요한 차이는 이러한 임시 방법을 사용하여 감지되지 않거나 가려질 수 있습니다. 마지막으로, 단일 세포 분석은 동기화나 정렬에 의존하지 않고 세포 주기 진행을 분석할 수 있지만13, 단일 세포 연구에서 대규모 측정은 어렵고 비용이 많이 들 수 있습니다.
이러한 어려움을 극복하기 위해 우리는 동기화된 집단14,15에 대한 시계열 측정 분석을 돕기 위해 CLOCCS(Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony) 모델을 개발했습니다. CLOCCS는 동기화된 세포가 동기화에서 해제되고 세포 주기를 통해 진행될 때 세포 주기 단계 전반에 걸쳐 동기화된 세포의 분포를 설명하는 유연한 수학적 모델입니다. 분지 과정 프레임워크를 통해 모델은 S. cerevisiae에서 관찰된 바와 같이 분열 후 모녀 세포의 비대칭 특성을 설명할 수 있으며 S. pombe와 같이 핵분열로 분열하는 유기체에 여전히 유용합니다. 이 모델은 다양한 측정 유형 세트에서 입력을 받아 셀 주기 단계를 지정할 수 있습니다. 그것은 시간 경과에 따른 발아 세포의 백분율 측정을 포함하는 발아 세포주기 단계 데이터를 수집 할 수 있으며, 발아되지 않은 G1 단계14,15 외부의 세포 수를 추정 할 수 있습니다. 이 모델은 또한 DNA 함량을 측정하는 유세포 분석 데이터를 수집할 수 있으므로 G1에서 S로, S에서 G2로, M에서 G1로 획기적인 전이를 평가할 수 있습니다15. 형광 형태학적 마커는 또한 세포 주기 단계를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 미오신 고리, 핵 및 방추극체(SPB)의 형광 표지는 세포 주기 단계를 결정하는 데 사용할 수 있으며 이들은 CLOCCS 모델11에 통합되었습니다. 그러나 이러한 측정은 이 프로토콜에서 설명되지 않습니다. 또한, septation index는 S. pombe14의 모델링 데이터를 위한 입력으로 사용되었습니다. 따라서 이 모델은 다양한 유기체의 세포 주기 분석에 사용할 수 있으며 추가로 확장할 수 있습니다.
CLOCCS는 입력 데이터에서 여러 매개변수(예: 신진 비율, DNA 함량)의 전체 베이지안 추론을 허용하는 매개변수 모델입니다. 이러한 매개변수에는 동기화로부터의 회복 시간, 세포 주기 기간의 길이(모녀 세포에 대해 별도로 추정됨) 및 각 시점에서 세포의 평균 세포 주기 위치가 포함됩니다. 이러한 매개변수는 모집단에서 평균 세포의 행동을 나타내므로 연구자는 각 시점을 생명선 지점으로 표현된 세포 주기 위치에 매핑할 수 있습니다. 라이프라인 포인트로의 변환은 CLOCCS 매개변수 lambda(λ) 및 mu0(μ0)14,15에 따라 달라집니다. 파라미터 λ는 모세포의 평균 세포 주기 주기에 상응한다. 그러나, 모녀 지연(14,15)으로 인해, 이것은 모녀 세포 모두를 포함하는 전체 집단의 평균 세포주기 기간이 아니다. CLOCCS는 모녀 지연에 해당하는 매개변수 델타(δ)를 추가로 추론하므로 전체 집단의 평균 세포 주기 기간을 계산할 수 있습니다. 마지막으로, 각 실험은 셀 주기 동기화에서 해제된 후에 시작되기 때문에 동기화 방법에서 복구하는 데 필요한 시간은 CLOCCS 매개 변수μ 0으로 표시됩니다. CLOCCS는 입력 셀 사이클 위상 데이터에 모델을 피팅한 다음 랜덤 워크 마르코프 체인 몬테카를로 알고리즘14,15를 사용하여 이러한 매개변수를 추론합니다. 여러 실험을 공통 세포 주기 수명 주기 시간 척도에 매핑함으로써 회복 시간 또는 세포 주기 기간이 동일하지 않은 복제 또는 실험 간에 직접적인 단계별 비교를 수행할 수 있습니다 8,14,15.
동기화된 모집단이 시계열14,15,16,17 동안 어느 정도 동기화성을 잃기 때문에 동기화 손실률의 변동성은 실험 전반에 걸친 정량적 비교를 방해할 수도 있습니다. CLOCCS는 모집단의 위치와 분포의 분산을 식별하여 동시성 손실률의 차이를 설명합니다. 이 강력한 도구는 실험 전반에 걸쳐 구체적이고 상세한 비교를 가능하게 하여 복제물 간뿐만 아니라 환경 조건, 돌연변이 및 심지어 세포 주기 타이밍이 크게 다른 종 간에도 관련 비교를 직접 수행할 수 있는 기능을 제공합니다14,15.
이 논문에서는 CLOCCS를 사용하여 동기/릴리스 시계열 실험의 데이터를 피팅하여 매개변수를 추정하고, 데이터를 공통 라이프라인 척도에 매핑한 다음, 반복 또는 실험 간에 관련 비교를 수행하는 방법을 설명합니다. 라이프라인 정렬을 통해 이러한 실험에서 직접 상별 비교가 가능하므로 복제물의 집계 및 비교가 가능하며 회복 타이밍 및 세포 주기 기간이 다른 실험 간에 보다 관련성 높은 비교를 수행할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문은 동기화된 세포 집단에 대한 시계열 실험의 데이터를 보다 정확하고 정량적으로 평가하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 각 실험을 파라미터화하기 위해 신진 데이터 및 유세포 분석 DNA 함량 데이터와 같은 입력 세포 주기 단계 데이터를 사용하는 베이지안 추론 모델인 CLOCCS에서 학습된 매개변수를 활용합니다(14,15). CLOCCS는 입력 세포 주기 단…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. Campione과 S. Haase는 국립 과학 재단 (DMS-1839288)과 국립 보건원 (5R01GM126555)의 자금 지원을 받았습니다. 또한 저자는 원고에 대한 의견과 프로토콜 베타 테스트에 대해 Huarui Zhou(Duke University)에게 감사를 표합니다. 또한 Java 코드에 도움을 준 Francis Motta(Florida Atlantic University)와 Joshua Robinson에게도 감사드립니다.
Materials
| 2x PBS | For Fixative Solution. Described in Leman 2014. | ||
| 4% formaldehyde | For Fixative Solution. | ||
| 100% Ethanol | For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002. | ||
| CLOCCS | https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git | ||
| Flow Cytometer | For flow cytometry protocol. | ||
| Git | https://git-scm.com/ | ||
| Java 19 | https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19 | ||
| Microscope | For counting cells and buds. | ||
| Miniconda | https://docs.conda.io/en/latest/ | ||
| Protease solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| RNAse A solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | For flow cytometry staining. Described in Haase 2002. |
| Tris | pH 7.5 |
Referências
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