Çapraz deney karşılaştırmaları için hücre döngüsü senkron modelinin karakterizleştirici kaybı kullanılarak senkronize zaman serisi verilerinin hizalanması
Summary
Senkronize zaman serisi deneylerini analiz etmenin bir zorluğu, deneylerin genellikle senkronizasyondan ve hücre döngüsü periyodundan kurtarma uzunluğunda farklılık göstermesidir. Bu nedenle, farklı deneylerden elde edilen ölçümler toplu olarak analiz edilemez veya kolayca karşılaştırılamaz. Burada, faza özgü karşılaştırmalara izin vermek için deneyleri hizalamak için bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Hücre döngüsünün araştırılması, genellikle, hücreler hücre döngüsünü geçerken bir zaman serisindeki çeşitli parametreleri ölçmek için hücre popülasyonlarının senkronize edilmesine bağlıdır. Bununla birlikte, benzer koşullar altında bile, tekrarlanan deneyler, senkronizasyondan kurtulmak ve hücre döngüsünü geçmek için gereken sürede farklılıklar gösterir, böylece her zaman noktasında doğrudan karşılaştırmaları önler. Deneyler arasında dinamik ölçümleri karşılaştırma sorunu, mutant popülasyonlarda veya senkron iyileşme süresini ve / veya hücre döngüsü periyodunu etkileyen alternatif büyüme koşullarında daha da kötüleşmektedir.
Daha önce, senkronize hücre popülasyonlarının senkronizasyondan nasıl salındığını ve hücre döngüsü boyunca nasıl ilerlediğini izleyen Hücre Döngüsü Senkron Kaybını Karakterize Etme (CLOCCS) adlı parametrik bir matematiksel model yayınladık. Modelden öğrenilen parametreler daha sonra deneysel zaman noktalarını senkronize zaman serisi deneylerinden normalleştirilmiş bir zaman ölçeğine (yaşam çizgisi noktaları) dönüştürmek için kullanılabilir. Yaşam çizgisi ölçeği, deneyin başlangıcından itibaren dakika cinsinden geçen süreyi temsil etmek yerine, senkronizasyondan hücre döngüsü girişine ve ardından hücre döngüsünün aşamalarına ilerlemeyi temsil eder. Yaşam çizgisi noktaları, senkronize edilmiş popülasyondaki ortalama hücrenin fazına karşılık geldiğinden, bu normalleştirilmiş zaman ölçeği, değişen periyotlara ve iyileşme sürelerine sahip olanlar da dahil olmak üzere deneyler arasında doğrudan karşılaştırmalara izin verir. Ayrıca, model, farklı türler (örneğin, Saccharomyces cerevisiae ve Schizosaccharomyces pombe) arasındaki hücre döngüsü deneylerini hizalamak için kullanılmıştır, böylece evrimsel benzerlikleri ve farklılıkları ortaya çıkarabilecek hücre döngüsü ölçümlerinin doğrudan karşılaştırılmasını sağlamıştır.
Introduction
Hücre döngüsü boyunca ilerlerken senkronize hücre popülasyonları üzerinde yapılan zaman serisi ölçümleri, hücre döngüsü ilerlemesini kontrol eden mekanizmaları araştırmak için standart bir yöntemdir 1,2,3,4,5,6,7,8 . Senkron / serbest bırakma zaman serisi deneyleri arasında karşılaştırmalar yapabilme yeteneği, bu dinamik süreçleri anlamamız için hayati öneme sahiptir. Bulguları doğrulamak için yinelenen deneylerin kullanılması, sonuçların tekrarlanabilirliğine olan güveni artırabilir. Ayrıca, çevresel koşullar, mutantlar ve hatta türler arasındaki karşılaştırmalar, hücre döngüsü düzenlemesine ilişkin birçok yeni anlayışı ortaya çıkarabilir. Bununla birlikte, senkronizasyondan ve hücre döngüsü ilerlemesinin hızından kurtulmadaki deneyler arası değişkenlik, replikalar arasında veya değiştirilmiş hücre döngüsü zamanlamasına sahip deneyler arasında zaman noktasından zaman noktasına karşılaştırmalar yapma yeteneğini bozar. Bu zorluklar nedeniyle, replikalar genellikle tam zamanlı serilere dahil edilmez (örneğin, Spellman ve ark.4). Tüm zaman serileri için çoğaltmalar toplandığında, veriler toplu olarak analiz edilemez, bunun yerine analiz için tek bir çoğaltma kullanılır ve diğer çoğaltmalar genellikle ek rakamlara indirgenir (örneğin, Orlando ve ark.8). Ayrıca, farklı iyileşme veya hücre döngüsü ilerleme özelliklerine sahip deneyler arasında karşılaştırmalar yapmak zordur. İlgilenilen bir olay ile bir hücre döngüsü dönüm noktası (örneğin, tomurcuk ortaya çıkışı, S-fazı girişi veya anafaz başlangıcı) arasındaki daha küçük aralıkların ölçümleri, bu dönüm noktası olayları 1,2,3,9,10,11,12 izlenirse hataları azaltmaya yardımcı olabilir. Bununla birlikte, ince ama önemli farklılıklar bu geçici yöntemler kullanılarak tespit edilemeyebilir veya gizlenebilir. Son olarak, tek hücreli analizler, senkronizasyona veya hizalamaya13 güvenmeden hücre döngüsü ilerlemesini analiz etmeye izin verir, ancak tek hücreli çalışmalarda büyük ölçekli ölçümler zor ve maliyetli olabilir.
Bu zorlukların üstesinden gelmek için, senkronize popülasyonlarda yapılan zaman serisi ölçümlerinin analizine yardımcı olmak için Hücre Döngüsü Senkron Kaybının Karakterize Edilmesi (CLOCCS) modelini geliştirdik14,15. CLOCCS, senkronize hücrelerin hücre döngüsü aşamaları boyunca dağılımını, senkronizasyondan serbest bırakıldıkça ve hücre döngüsü boyunca ilerledikçe tanımlayan esnek bir matematiksel modeldir. Dallanma süreci çerçevesi, modelin, S. cerevisiae’de gözlemlendiği gibi, bölünmeden sonra anne ve kız hücrelerinin asimetrik niteliklerini hesaba katmasını sağlarken, S. pombe gibi fisyonla bölünen organizmalar için hala yararlıdır. Model, hücre döngüsü fazını belirtmek için çeşitli ölçüm türleri kümesinden girdiler alabilir. Zaman içinde tomurcuklanan hücrelerin yüzdesinin ölçümlerini içeren tomurcuklanan hücre döngüsü faz verilerini alabilir ve tomurcuklanmamış G1 fazı14,15’in dışındaki hücre sayısının tahmin edilmesine izin verir. Model ayrıca DNA içeriğini ölçen akış sitometrik verilerini de alabilir, böylece G1’den S’ye, S’den G2’ye ve M’den G115’e dönüm noktası geçişlerinin değerlendirilmesini sağlar. Floresan morfolojik belirteçler, hücre döngüsü fazını tanımlamak için de kullanılabilir. Miyozin halkalarının, çekirdeklerin ve iğ kutup gövdelerinin (SPB’ler) floresan etiketlemesi, hücre döngüsü fazını belirlemek için kullanılabilir ve bunlar CLOCCS model11’e dahil edilmiştir; ancak, bu ölçümler bu protokolde açıklanmayacaktır. Ek olarak, septasyon indeksi S. pombe14’ten gelen verileri modellemek için bir girdi olarak kullanılmıştır. Böylece, model çeşitli organizmalarda hücre döngüsü analizleri için kullanılabilir ve daha da genişletilebilir.
CLOCCS, giriş verilerinden çoklu parametrelerin (örneğin, tomurcuklanma yüzdesi, DNA içeriği) tam Bayes çıkarımına izin veren parametrik bir modeldir. Bu parametreler, senkronizasyondan kurtarma süresini, hücre döngüsü periyodunun uzunluğunu (anne ve yavru hücreler için ayrı ayrı tahmin edilir) ve hücrelerin her zaman noktasındaki ortalama hücre döngüsü konumunu içerir. Bu parametreler, popülasyondaki ortalama hücrenin davranışını temsil eder ve araştırmacının her zaman noktasını bir yaşam çizgisi noktası olarak ifade edilen bir hücre döngüsü konumuna haritalamasını sağlar. Yaşam çizgisi noktalarına dönüşüm, CLOCCS parametreleri lambda (λ) ve mu0 (μ0)14,15’e bağlıdır. λ parametresi, ana hücrelerin ortalama hücre döngüsü süresine karşılık gelir. Bununla birlikte, anne-kız gecikmesi14,15 nedeniyle, bu hem anne hem de kız hücrelerini içeren tüm popülasyonun ortalama hücre döngüsü periyodu değildir. CLOCCS ayrıca anne-kız gecikmesine karşılık gelen delta (δ) parametresini çıkarır ve böylece tüm popülasyonun ortalama hücre döngüsü periyodunun hesaplanmasına izin verir. Son olarak, her deneme hücre döngüsü eşitlemesinden serbest bırakıldıktan sonra başladığından, eşitleme yönteminden kurtarmak için gereken süre0 μ CLOCCS parametresiyle temsil edilir. CLOCCS, giriş hücresi döngüsü faz verilerine bir model sığdırır ve daha sonra rastgele bir yürüyüş Markov zinciri Monte Carlo algoritması14,15 kullanarak bu parametreleri çıkarır. Birden fazla deneyi ortak bir hücre döngüsü yaşam çizgisi zaman ölçeğine eşleyerek, iyileşme süresinin veya hücre döngüsü dönemlerinin aynı olmadığı çoğaltmalar veya deneyler arasında doğrudan faza özgü karşılaştırmalar yapılabilir 8,14,15.
Senkronize popülasyonlar14,15,16,17 zaman serisi boyunca bir oranda senkronizasyonu kaybettiğinden, senkronizasyon kaybı oranındaki değişkenlik deneyler arasında nicel karşılaştırmaları da engelleyebilir. Popülasyonların yerini ve dağılımlarındaki varyansı tanımlayarak, CLOCCS senkronize kayıp oranlarındaki farklılıkları açıklar. Bu güçlü araç, deneyler arasında spesifik ve ayrıntılı karşılaştırmalara izin verir, böylece sadece replikalar arasında değil, aynı zamanda çevresel koşullar, mutantlar ve hatta önemli ölçüde farklı hücre döngüsü zamanlamasına sahip türler arasında da doğrudan ilgili karşılaştırmalar yapma yeteneği sağlar14,15.
Bu makalede, senkronizasyon/sürüm zaman serisi deneylerinden gelen verileri sığdırarak parametreleri tahmin etmek, verileri ortak bir yaşam çizgisi ölçeğine eşlemek ve ardından çoğaltmalar veya deneyler arasında ilgili karşılaştırmalar yapmak için CLOCCS’yi kullanan bir yöntem açıklanmaktadır. Yaşam çizgisi hizalaması, bu deneyler arasında doğrudan faza özgü karşılaştırmalara izin verir, bu da kopyaların toplanmasına ve karşılaştırılmasına ve farklı kurtarma zamanlamaları ve hücre döngüsü dönemlerine sahip deneyler arasında daha alakalı karşılaştırmalar yapılmasına olanak tanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makale, senkronize hücre popülasyonları üzerindeki zaman serisi deneylerinden elde edilen verileri daha doğru ve nicel olarak değerlendirmek için bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, her deneyi14,15 parametrelendirmek için tomurcuklanan veriler ve akış-sitometrik DNA içerik verileri gibi giriş hücresi döngüsü faz verilerini kullanan bir Bayes çıkarım modeli olan CLOCCS’den öğrenilen parametreleri kullanır. CLOCCS, her bir deneyin parametrel…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. Campione ve S. Haase, Ulusal Bilim Vakfı (DMS-1839288) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (5R01GM126555) tarafından finanse edildi. Ek olarak, yazarlar makale hakkındaki yorumları ve protokolün beta testi için Huarui Zhou’ya (Duke Üniversitesi) teşekkür eder. Ayrıca Francis Motta (Florida Atlantik Üniversitesi) ve Joshua Robinson’a Java koduyla ilgili yardımları için teşekkür ederiz.
Materials
| 2x PBS | For Fixative Solution. Described in Leman 2014. | ||
| 4% formaldehyde | For Fixative Solution. | ||
| 100% Ethanol | For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002. | ||
| CLOCCS | https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git | ||
| Flow Cytometer | For flow cytometry protocol. | ||
| Git | https://git-scm.com/ | ||
| Java 19 | https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19 | ||
| Microscope | For counting cells and buds. | ||
| Miniconda | https://docs.conda.io/en/latest/ | ||
| Protease solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| RNAse A solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | For flow cytometry staining. Described in Haase 2002. |
| Tris | pH 7.5 |
Referências
- Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
- Schwob, E., Nasmyth, K. CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).
- Polymenis, M., Schmidt, E. V. Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast. Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).
- Spellman, P. T., et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization. Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).
- Cho, R. J., et al. A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).
- Bar-Joseph, Z. Analyzing time series gene expression data. Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).
- Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle. Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).
- Orlando, D. A., et al. Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators. Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).
- Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog. EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).
- Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).
- Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments. Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).
- Qu, Y., et al. Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast. Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).
- Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle. Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).
- Orlando, D. A., et al. A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments. Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).
- Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments. Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).
- Duan, F., Zhang, H. Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights. Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).
- Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).
- Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle. Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).
- Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).
- Haase, S. B., Reed, S. I. Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle. Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).
- Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. PLoS Genetics. 12 (12), e1006453 (2016).
- Kelliher, C. M., et al. Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data. Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).
- Smith, L. M., et al. An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Science. 368 (6492), 754-759 (2020).
