Abgleich von synchronisierten Zeitreihendaten unter Verwendung des Modells zur Charakterisierung des Zellzyklusverlusts für experimentübergreifende Vergleiche

Summary

Eine Herausforderung bei der Analyse synchronisierter Zeitreihenexperimente besteht darin, dass sich die Experimente oft in der Dauer der Erholung von der Synchronität und der Zellzyklusperiode unterscheiden. Daher können die Messungen aus verschiedenen Experimenten nicht aggregiert analysiert oder ohne weiteres verglichen werden. Hier beschreiben wir eine Methode zur Ausrichtung von Experimenten, um phasenspezifische Vergleiche zu ermöglichen.

Abstract

Die Untersuchung des Zellzyklus hängt oft von der Synchronisierung von Zellpopulationen ab, um verschiedene Parameter in einer Zeitreihe zu messen, während die Zellen den Zellzyklus durchlaufen. Aber auch unter ähnlichen Bedingungen zeigen Replikationsexperimente Unterschiede in der Zeit, die benötigt wird, um sich von der Synchronität zu erholen und den Zellzyklus zu durchlaufen, wodurch direkte Vergleiche zu jedem Zeitpunkt verhindert werden. Das Problem des Vergleichs dynamischer Messungen in verschiedenen Experimenten wird in mutierten Populationen oder unter alternativen Wachstumsbedingungen, die sich auf die synchrone Erholungszeit und/oder die Zellzykluszeit auswirken, noch verschärft.

Wir haben bereits ein parametrisches mathematisches Modell mit dem Namen Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) veröffentlicht, das überwacht, wie sich synchrone Zellpopulationen aus der Synchronität lösen und den Zellzyklus durchlaufen. Die gelernten Parameter aus dem Modell können dann verwendet werden, um experimentelle Zeitpunkte aus synchronisierten Zeitreihenexperimenten in eine normalisierte Zeitskala (Lebenslinienpunkte) umzuwandeln. Anstatt die verstrichene Zeit in Minuten seit Beginn des Experiments darzustellen, stellt die Lebenslinienskala den Verlauf von der Synchronität zum Eintritt in den Zellzyklus und dann durch die Phasen des Zellzyklus dar. Da die Lebenslinienpunkte der Phase der durchschnittlichen Zelle innerhalb der synchronisierten Population entsprechen, ermöglicht diese normalisierte Zeitskala direkte Vergleiche zwischen Experimenten, einschließlich solcher mit unterschiedlichen Zeiträumen und Erholungszeiten. Darüber hinaus wurde das Modell verwendet, um Zellzyklusexperimente zwischen verschiedenen Arten (z.B. Saccharomyces cerevisiae und Schizosaccharomyces pombe) aufeinander abzustimmen, wodurch ein direkter Vergleich von Zellzyklusmessungen ermöglicht wird, die evolutionäre Ähnlichkeiten und Unterschiede aufzeigen können.

Introduction

Zeitreihenmessungen an synchronisierten Zellpopulationen auf ihrem Weg durch den Zellzyklus sind eine Standardmethode zur Untersuchung der Mechanismen, die das Fortschreiten des Zellzyklus steuern 1,2,3,4,5,6,7,8 . Die Fähigkeit, Vergleiche zwischen Synchronie-/Release-Zeitreihenexperimenten anzustellen, ist für unser Verständnis dieser dynamischen Prozesse von entscheidender Bedeutung. Die Verwendung von Wiederholungsexperimenten zur Bestätigung der Ergebnisse kann das Vertrauen in die Reproduzierbarkeit der Schlussfolgerungen erhöhen. Darüber hinaus können Vergleiche zwischen Umweltbedingungen, Mutanten und sogar zwischen Spezies viele neue Erkenntnisse über die Regulation des Zellzyklus liefern. Die interexperimentelle Variabilität in der Erholung von der Synchronität und in der Geschwindigkeit des Zellzyklusfortschritts beeinträchtigt jedoch die Fähigkeit, Zeitpunkt-zu-Zeitpunkt-Vergleiche zwischen Replikaten oder zwischen Experimenten mit verändertem Zellzyklus-Timing anzustellen. Aufgrund dieser Herausforderungen werden Replikate oft nicht für die gesamte Zeitreihe einbezogen (z. B. Spellman et ^al.4). Wenn Replikationen für die gesamte Zeitreihe gesammelt werden, können die Daten nicht aggregiert analysiert werden, sondern es wird ein einzelnes Replikat für die Analyse verwendet, und andere Replikate werden oft auf zusätzliche Zahlen verwiesen (z. B. Orlando et ^al.8). Darüber hinaus sind Vergleiche zwischen Experimenten mit unterschiedlichen Erholungs- oder Zellzyklus-Progressionsmerkmalen schwierig. Die Messung kleinerer Intervalle zwischen einem Ereignis von Interesse und einem Meilenstein des Zellzyklus (z. B. Knospenaufgang, Eintritt in die S-Phase oder Beginn der Anaphase) kann dazu beitragen, Fehler zu reduzieren, wenn diese Orientierungsereignisse verfolgt werden 1,2,3,9,10,11,12. Subtile, aber wichtige Unterschiede können jedoch bei diesen Ad-hoc-Methoden unentdeckt oder verschleiert bleiben. Schließlich ermöglichen Einzelzellanalysen die Analyse des Zellzyklusverlaufs, ohne auf Synchronisation oder Ausrichtung angewiesen zu sein¹³, obwohl groß angelegte Messungen in Einzelzellstudien schwierig und kostspielig sein können.

Um diese Schwierigkeiten zu überwinden, haben wir das Modell Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) entwickelt, um die Analyse von Zeitreihenmessungen an synchronisierten Populationen zu unterstützen^14,15. CLOCCS ist ein flexibles mathematisches Modell, das die Verteilung synchronisierter Zellen über die Phasen des Zellzyklus hinweg beschreibt, wenn sie aus der Synchronität befreit werden und den Zellzyklus durchlaufen. Der Rahmen für den Verzweigungsprozess ermöglicht es dem Modell, die asymmetrischen Eigenschaften von Mutter- und Tochterzellen nach der Teilung zu berücksichtigen, wie sie bei S. cerevisiae beobachtet wurden, während es für Organismen, die sich durch Spaltung teilen, wie z. B. S. pombe, immer noch nützlich ist. Das Modell kann Eingaben aus einer Vielzahl von Messtypen verwenden, um die Zellzyklusphase zu spezifizieren. Es kann Phasendaten des knospenden Zellzyklus aufnehmen, die Messungen des Prozentsatzes der knospenden Zellen im Laufe der Zeit enthalten, was die Schätzung der Anzahl der Zellen außerhalb der nicht knospenden G1-Phase ermöglicht^14,15. Das Modell kann auch durchflusszytometrische Daten aufnehmen, die den DNA-Gehalt messen, und ermöglicht so die Beurteilung von Landmark-Übergängen von G1 zu S, S zu G2 und M zu G1¹⁵. Fluoreszierende morphologische Marker können auch verwendet werden, um die Phase des Zellzyklus zu identifizieren. Die Fluoreszenzmarkierung von Myosinringen, Zellkernen und Spindelpolkörpern (SPBs) kann zur Bestimmung der Zellzyklusphase verwendet werden, und diese wurden in das CLOCCS-Modell¹¹ integriert. Diese Messungen werden in diesem Protokoll jedoch nicht beschrieben. Zusätzlich wurde der Septationsindex als Input für die Modellierung von Daten von S. pombe¹⁴ verwendet. Somit kann das Modell für Zellzyklusanalysen in einer Vielzahl von Organismen eingesetzt und weiter ausgebaut werden.

CLOCCS ist ein parametrisches Modell, das die vollständige Bayes’sche Inferenz mehrerer Parameter aus den Eingabedaten (z. B. Knospungsprozentsatz, DNA-Gehalt) ermöglicht. Zu diesen Parametern gehören die Erholungszeit von der Synchronität, die Länge der Zellzyklusperiode (getrennt geschätzt für Mutter- und Tochterzellen) und die durchschnittliche Zellzyklusposition der Zellen zu jedem Zeitpunkt. Diese Parameter repräsentieren das Verhalten der durchschnittlichen Zelle in der Population und ermöglichen es dem Forscher, jeden Zeitpunkt einer Zellzyklusposition zuzuordnen, die als Lebenslinienpunkt ausgedrückt wird. Die Umrechnung in Seilsicherungspunkte hängt von den CLOCCS-Parametern lambda (λ) und mu0 (μ₀)^14,15 ab. Der Parameter λ entspricht der durchschnittlichen Zellzykluszeit der Mutterzellen. Aufgrund der Mutter-Tochter-Verzögerung^14,15 ist dies jedoch nicht die durchschnittliche Zellzyklusperiode der gesamten Population, die sowohl die Mutter- als auch die Tochterzellen umfasst. CLOCCS leitet zusätzlich den Parameter delta (δ ab, der der Mutter-Tochter-Verzögerung entspricht und somit die Berechnung der durchschnittlichen Zellzyklusperiode der gesamten Population ermöglicht. Da jedes Experiment nach der Freigabe der Zellzyklussynchronisierung beginnt, wird die Zeit, die für die Wiederherstellung nach der Synchronisationsmethode erforderlich ist, durch den CLOCCS-Parameter μ₀ dargestellt. CLOCCS passt ein Modell an die eingegebenen Zellzyklus-Phasendaten an und leitet diese Parameter dann mit einem Random-Walk-Markov-Ketten-Monte-Carlo-Algorithmus^{ab 14,15}. Durch die Zuordnung mehrerer Experimente zu einer gemeinsamen Zeitskala der Zellzykluslebenslinie können direkte phasenspezifische Vergleiche zwischen Replikaten oder Experimenten durchgeführt werden, bei denen die Erholungszeit oder die Zellzykluszeiten nicht identisch sind 8,14,15.

Da synchronisierte Populationen im Laufe der Zeitreihen^14,15,16,17 mit einer gewissen Rate an Synchronität verlieren^, kann die Variabilität der Rate des Synchronitätsverlusts auch quantitative Vergleiche zwischen Experimenten erschweren. Durch die Identifizierung der Position von Populationen und der Varianz in ihren Verteilungen berücksichtigt CLOCCS Unterschiede in den Raten des Synchronitätsverlusts. Dieses leistungsstarke Werkzeug ermöglicht spezifische und detaillierte Vergleiche zwischen Experimenten und bietet so die Möglichkeit, relevante Vergleiche nicht nur zwischen Replikaten, sondern auch zwischen Umweltbedingungen, Mutanten und sogar Spezies mit dramatisch unterschiedlichem Zellzyklus-Timing direkt durchzuführen^14,15.

In diesem Artikel wird eine Methode beschrieben, die CLOCCS verwendet, um Parameter zu schätzen, indem Daten aus Synchronie-/Release-Zeitreihenexperimenten angepasst, die Daten einer gemeinsamen Lebenslinienskala zugeordnet und dann relevante Vergleiche zwischen Wiederholungen oder Experimenten durchgeführt werden. Die Ausrichtung der Lebenslinie ermöglicht direkte phasenspezifische Vergleiche zwischen diesen Experimenten, was die Aggregation und den Vergleich von Replikaten sowie relevantere Vergleiche zwischen Experimenten mit unterschiedlichen Erholungszeiten und Zellzyklusperioden ermöglicht.

Protocol

1. Sammeln von Zellzyklusphasen- und experimentellen Daten Synchronisieren Sie die Zellen in Bezug auf den Zellzyklus unter Verwendung der gewünschten Synchronisationsmethode (z. B. zentrifugale Abschlämmung, wie in Leman et al.18 beschrieben, oder Paarungspheromonarrest, wie in Rosebrock 19 beschrieben; sowohl Leman et al.18 als auch Rosebrock 19 beinhalten auch Methoden zur Freisetzung aus der Synchronität).<sup class=…

Representative Results

Die im obigen Protokoll und im Workflow in Abbildung 1 beschriebenen Schritte wurden auf fünf Zellzyklus-synchronisierte Zeitreihenexperimente angewendet, um zwei repräsentative Vergleiche zu demonstrieren: zwischen Replikaten mit unterschiedlichen Synchronitätsmethoden (Paarungspheromon und zentrifugale Elutriierung18) und Sequenzierungsplattformen (RNA-Sequenzierung [RNA-seq] und Microarray) sowie zwischen experimentellen Bedingungen. Es wurden mehrere Experi…

Discussion

In dieser Arbeit wird eine Methode vorgestellt, mit der Daten aus Zeitreihenexperimenten an synchronisierten Zellpopulationen genauer und quantitativ ausgewertet werden können. Die Methode verwendet erlernte Parameter von CLOCCS, einem Bayes’schen Inferenzmodell, das Eingabedaten der Zellzyklusphase, wie z. B. Knospungsdaten und durchflusszytometrische DNA-Inhaltsdaten, verwendet, um jedes Experiment zu parametrisieren^14,15. CLOCCS verwendet die eingegebenen Zel…

Materials

2x PBS			For Fixative Solution. Described in Leman 2014.
4% formaldehyde			For Fixative Solution.
100% Ethanol			For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002.
CLOCCS			https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git
Flow Cytometer			For flow cytometry protocol.
Git			https://git-scm.com/
Java 19			https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19
Microscope			For counting cells and buds.
Miniconda			https://docs.conda.io/en/latest/
Protease solution			For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
RNAse A solution			For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002.
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	Invitrogen	S7020	For flow cytometry staining. Described in Haase 2002.
Tris			pH 7.5