Justering av synkroniserte tidsseriedata ved bruk av karakteriserende tap av cellesyklussynkronimodell for sammenligninger på tvers av eksperimenter
Summary
En utfordring med å analysere synkroniserte tidsserieeksperimenter er at eksperimentene ofte varierer i lengden på utvinning fra synkroni og cellesyklusperioden. Dermed kan målingene fra forskjellige eksperimenter ikke analyseres samlet eller lett sammenlignes. Her beskriver vi en metode for å justere eksperimenter for å muliggjøre fasespesifikke sammenligninger.
Abstract
Undersøkelse av cellesyklusen avhenger ofte av å synkronisere cellepopulasjoner for å måle ulike parametere i en tidsserie når cellene krysser cellesyklusen. Men selv under lignende forhold viser replikasjonseksperimenter forskjeller i tiden som kreves for å gjenopprette fra synkroni og å krysse cellesyklusen, og forhindrer dermed direkte sammenligninger på hvert tidspunkt. Problemet med å sammenligne dynamiske målinger på tvers av eksperimenter forverres i mutante populasjoner eller i alternative vekstbetingelser som påvirker synkron gjenopprettingstid og / eller cellesyklusperioden.
Vi har tidligere publisert en parametrisk matematisk modell kalt Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) som overvåker hvordan synkrone populasjoner av celler frigjøres fra synkronisering og fremgang gjennom cellesyklusen. De lærte parametrene fra modellen kan deretter brukes til å konvertere eksperimentelle tidspunkter fra synkroniserte tidsserieeksperimenter til en normalisert tidsskala (livslinjepunkter). I stedet for å representere forløpt tid i minutter fra starten av eksperimentet, representerer livslinjeskalaen progresjonen fra synkroni til cellesyklusoppføring og deretter gjennom fasene i cellesyklusen. Siden livslinjepunkter tilsvarer fasen til gjennomsnittscellen i den synkroniserte populasjonen, tillater denne normaliserte tidsskalaen direkte sammenligninger mellom eksperimenter, inkludert de med varierende perioder og gjenopprettingstider. Videre har modellen blitt brukt til å justere cellesykluseksperimenter mellom forskjellige arter (f.eks. Saccharomyces cerevisiae og Schizosaccharomyces pombe), og dermed muliggjøre direkte sammenligning av cellesyklusmålinger, som kan avsløre evolusjonære likheter og forskjeller.
Introduction
Tidsseriemålinger gjort på synkroniserte populasjoner av celler når de går gjennom cellesyklusen er en standardmetode for å undersøke mekanismene som styrer cellesyklusprogresjon 1,2,3,4,5,6,7,8 . Evnen til å gjøre sammenligninger på tvers av synkrone / utgivelsestidsserieeksperimenter er avgjørende for vår forståelse av disse dynamiske prosessene. Bruk av replikerte eksperimenter for å bekrefte funn kan øke tilliten til reproduserbarheten av konklusjonene. Videre kan sammenligninger mellom miljøforhold, på tvers av mutanter, og til og med mellom arter avdekke mange nye innsikter i cellesyklusregulering. Imidlertid svekker intereksperimentell variabilitet i utvinningen fra synkronisering og i hastigheten på cellesyklusprogresjon evnen til å gjøre tidspunkt-til-tidspunkt-sammenligninger på tvers av replikater eller mellom eksperimenter med endret cellesyklustiming. På grunn av disse utfordringene er replikater ofte ikke inkludert for hele tidsserien (f.eks. Spellman et al.4). Når replikater for hele tidsserien samles inn, kan ikke dataene analyseres samlet, men i stedet brukes en enkelt replikat til analyse, og andre replikater blir ofte henvist til tilleggstall (f.eks. Orlando et al.8). Videre er sammenligninger mellom eksperimenter med forskjellige restitusjons- eller cellesyklusprogresjonsegenskaper vanskelige. Målingene av mindre intervaller mellom en hendelse av interesse og et landemerke for cellesyklus (f.eks. knoppvekst, S-faseinngang eller anafasestart) kan bidra til å redusere feil hvis disse landemerkehendelsene spores 1,2,3,9,10,11,12. Imidlertid kan subtile, men viktige forskjeller forbli uoppdaget eller skjult ved hjelp av disse ad hoc-metodene. Endelig tillater enkeltcelleanalyser å analysere cellesyklusprogresjon uten å stole på synkronisering eller justering13, selv om storskala målinger i enkeltcellestudier kan være utfordrende og kostbare.
For å overvinne disse vanskelighetene utviklet vi modellen Characterizing Loss of Cell Cycle Synchrony (CLOCCS) for å hjelpe analysen av tidsseriemålinger gjort på synkroniserte populasjoner14,15. CLOCCS er en fleksibel matematisk modell som beskriver fordelingen av synkroniserte celler over cellesyklusfaser når de frigjøres fra synkronisering og går gjennom cellesyklusen. Forgreningsprosessrammen gjør det mulig for modellen å redegjøre for de asymmetriske egenskapene til mor- og datterceller etter deling, som observert i S. cerevisiae, samtidig som den fortsatt er nyttig for organismer som deler seg ved fisjon, som S. pombe. Modellen kan ta innganger fra et mangfoldig sett med måletyper for å spesifisere cellesyklusfasen. Det kan innta spirende cellesyklusfasedata, som inkluderer målinger av prosentandelen budded celler over tid, noe som muliggjør estimering av antall celler utenfor den unbudded G1 fase14,15. Modellen kan også innta flowcytometriske data som måler DNA-innholdet, og dermed muliggjøre vurdering av landemerkeoverganger fra G1 til S, S til G2 og M til G115. Fluorescerende morfologiske markører kan også brukes til å identifisere cellesyklusfasen. Den fluorescerende merkingen av myosinringer, kjerner og spindelpollegemer (SPB) kan brukes til å bestemme cellesyklusfasen, og disse ble innlemmet i CLOCCS-modellen11; Disse målingene vil imidlertid ikke bli beskrevet i denne protokollen. I tillegg ble septasjonsindeksen brukt som input for modellering av data fra S. pombe14. Dermed kan modellen brukes til cellesyklusanalyser i en rekke organismer og kan utvides ytterligere.
CLOCCS er en parametrisk modell som muliggjør full bayesiansk slutning av flere parametere fra inngangsdataene (f.eks. spirende prosentandel, DNA-innhold). Disse parametrene inkluderer gjenopprettingstiden fra synkronisering, lengden på cellesyklusperioden (estimert separat for mor- og datterceller) og den gjennomsnittlige cellesyklusposisjonen til cellene på hvert tidspunkt. Disse parametrene representerer oppførselen til gjennomsnittscellen i befolkningen, slik at forskeren kan kartlegge hvert tidspunkt til en cellesyklusposisjon uttrykt som et livslinjepunkt. Konverteringen til livslinjepunkter avhenger av CLOCCS-parametrene lambda (λ) og mu0 (μ0)14,15. Parameteren λ tilsvarer den gjennomsnittlige cellesyklusperioden til modercellene. På grunn av mor-datter-forsinkelsen14,15 er dette imidlertid ikke den gjennomsnittlige cellesyklusperioden for hele befolkningen som inkluderer både mor- og dattercellene. CLOCCS utleder i tillegg parameteren delta (δ), som tilsvarer mor-datter-forsinkelsen og dermed tillater beregning av gjennomsnittlig cellesyklusperiode for hele befolkningen. Til slutt, fordi hvert eksperiment begynner etter frigjøring fra cellesyklussynkronisering, representeres tiden det tar å gjenopprette fra synkroniseringsmetoden av CLOCCS-parameteren μ0. CLOCCS tilpasser en modell til inngangscellesyklusfasedataene og utleder deretter disse parametrene ved hjelp av en tilfeldig Markov-kjede Monte Carlo-algoritme14,15. Ved å kartlegge flere eksperimenter til en felles tidsskala for cellesyklus, kan direkte fasespesifikke sammenligninger gjøres mellom replikater eller eksperimenter der gjenopprettingstiden eller cellesyklusperiodene ikke er identiske 8,14,15.
Ettersom synkroniserte populasjoner mister synkroni i noen hastighet i løpet av tidsserien14,15,16,17, kan variabilitet i frekvensen av synkront tap også hindre kvantitative sammenligninger på tvers av eksperimenter. Ved å identifisere plasseringen av populasjoner og variansen i deres fordelinger, står CLOCCS for forskjeller i frekvenser av synkront tap. Dette kraftige verktøyet muliggjør spesifikke og detaljerte sammenligninger på tvers av eksperimenter, og gir dermed muligheten til direkte å gjøre relevante sammenligninger, ikke bare mellom replikater, men også mellom miljøforhold, mutanter og til og med arter som har dramatisk forskjellig cellesyklustid14,15.
Denne artikkelen beskriver en metode som bruker CLOCCS til å estimere parametere ved å tilpasse data fra synkrone / frigjøre tidsserieeksperimenter, kartlegge dataene til en felles livslinjeskala og deretter gjøre relevante sammenligninger mellom replikater eller eksperimenter. Livslinjejustering muliggjør direkte fasespesifikke sammenligninger på tvers av disse eksperimentene, noe som gjør det mulig å aggregere og sammenligne replikater og for å gjøre mer relevante sammenligninger på tvers av eksperimenter med forskjellige gjenopprettingstidspunkter og cellesyklusperioder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikkelen presenterer en metode for mer nøyaktig og kvantitativt å vurdere data fra tidsserieeksperimenter på synkroniserte populasjoner av celler. Metoden benytter lærte parametere fra CLOCCS, en bayesiansk inferensmodell som bruker inngangscellesyklusfasedata, for eksempel spirende data og flow-cytometriske DNA-innholdsdata, for å parameterisere hvert eksperiment14,15. CLOCCS bruker inndatacellesyklusfasedataene til å utlede parametrene for hvert e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S. Campione og S. Haase ble støttet av finansiering fra National Science Foundation (DMS-1839288) og National Institutes of Health (5R01GM126555). I tillegg vil forfatterne takke Huarui Zhou (Duke University) for kommentarer til manuskriptet og for betatesting av protokollen. Vi takker også Francis Motta (Florida Atlantic University) og Joshua Robinson for deres hjelp med Java-koden.
Materials
| 2x PBS | For Fixative Solution. Described in Leman 2014. | ||
| 4% formaldehyde | For Fixative Solution. | ||
| 100% Ethanol | For flow cytometry fixation. Described in Haase 2002. | ||
| CLOCCS | https://gitlab.com/haase-lab-group/cloccs_alignment.git | ||
| Flow Cytometer | For flow cytometry protocol. | ||
| Git | https://git-scm.com/ | ||
| Java 19 | https://www.oracle.com/java/technologies/downloads/#java19 | ||
| Microscope | For counting cells and buds. | ||
| Miniconda | https://docs.conda.io/en/latest/ | ||
| Protease solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| RNAse A solution | For flow cytometry protocol. Described in Haase 2002. | ||
| SYTOX Green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | For flow cytometry staining. Described in Haase 2002. |
| Tris | pH 7.5 |
Referências
- Tyers, M., Tokiwa, G., Futcher, B. Comparison of the Saccharomyces cerevisiae G1 cyclins: Cln3 may be an upstream activator of Cln1, Cln2 and other cyclins. EMBO Journal. 12 (5), 1955-1968 (1993).
- Schwob, E., Nasmyth, K. CLB5 and CLB6, a new pair of B cyclins involved in DNA replication in Saccharomyces cerevisiae. Genes and Development. 7, 1160-1175 (1993).
- Polymenis, M., Schmidt, E. V. Coupling of cell division to cell growth by translational control of the G1 cyclin CLN3 in yeast. Genes and Development. 11 (19), 2522-2531 (1997).
- Spellman, P. T., et al. Comprehensive identification of cell cycle-regulated genes of the yeast Saccharomyces cerevisiae by microarray hybridization. Molecular Biology of the Cell. 9 (12), 3273-3297 (1998).
- Cho, R. J., et al. A genome-wide transcriptional analysis of the mitotic cell cycle. Molecular Cell. 2 (1), 65-73 (1998).
- Bar-Joseph, Z. Analyzing time series gene expression data. Bioinformatics. 20 (16), 2493-2503 (2004).
- Pramila, T., Wu, W., Miles, S., Noble, W. S., Breeden, L. L. The Forkhead transcription factor Hcm1 regulates chromosome segregation genes and fills the S-phase gap in the transcriptional circuitry of the cell cycle. Genes and Development. 20 (16), 2266-2278 (2006).
- Orlando, D. A., et al. Global control of cell-cycle transcription by coupled CDK and network oscillators. Nature. 453 (7197), 944-947 (2008).
- Nash, R., Tokiwa, G., Anand, S., Erickson, K., Futcher, A. B. The WHI1+ gene of Saccharomyces cerevisiae tethers cell division to cell size and is a cyclin homolog. EMBO Journal. 7 (13), 4335-4346 (1988).
- Basco, R. D., Segal, M. D., Reed, S. I. Negative regulation of G1 and G2 by S-phase cyclins of Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 15 (9), 5030-5042 (1995).
- Mayhew, M. B., Robinson, J. W., Jung, B., Haase, S. B., Hartemink, A. J. A generalized model for multi-marker analysis of cell cycle progression in synchrony experiments. Bioinformatics. 27 (13), 295-303 (2011).
- Qu, Y., et al. Cell cycle inhibitor Whi5 records environmental information to coordinate growth and division in yeast. Cell Reports. 29 (4), 987-994 (2019).
- Di Talia, S., Skotheim, J. M., Bean, J. M., Siggia, E. D., Cross, F. R. The effects of molecular noise and size control on variability in the budding yeast cell cycle. Nature. 448 (7156), 947-951 (2007).
- Orlando, D. A., et al. A probabilistic model for cell cycle distributions in synchrony experiments. Cell Cycle. 6 (4), 478-488 (2007).
- Orlando, D. A., Iversen, E. S., Hartemink, A. J., Haase, S. B. A branching process model for flow cytometry and budding index measurements in cell synchrony experiments. Annals of Applied Statistics. 3 (4), 1521-1541 (2009).
- Duan, F., Zhang, H. Correcting the loss of cell-cycle synchrony in clustering analysis of microarray data using weights. Bioinformatics. 20 (11), 1766-1771 (2004).
- Darzynkiewicz, Z., Halicka, H. D., Zhao, H. Cell synchronization by inhibitors of DNA replication induces replication stress and DNA damage response: analysis by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 761, 85-96 (2011).
- Leman, A. R., Bristow, S. L., Haase, S. B. Analyzing transcription dynamics during the budding yeast cell cycle. Methods in Molecular Biology. 1170, 295-312 (2014).
- Rosebrock, A. P. Synchronization and arrest of the budding yeast cell cycle using chemical and genetic methods. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (1), (2017).
- Haase, S. B., Reed, S. I. Improved flow cytometric analysis of the budding yeast cell cycle. Cell Cycle. 1 (2), 132-136 (2002).
- Kelliher, C. M., Leman, A. R., Sierra, C. S., Haase, S. B. Investigating conservation of the cell-cycle-regulated transcriptional program in the fungal pathogen, Cryptococcus neoformans. PLoS Genetics. 12 (12), e1006453 (2016).
- Kelliher, C. M., et al. Layers of regulation of cell-cycle gene expression in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 2644-2655 (2018).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: An efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. Journal of Biological Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Deckard, A., Anafi, R. C., Hogenesch, J. B., Haase, S. B., Harer, J. Design and analysis of large-scale biological rhythm studies: A comparison of algorithms for detecting periodic signals in biological data. Bioinformatics. 29 (24), 3174-3180 (2013).
- Smith, L. M., et al. An intrinsic oscillator drives the blood stage cycle of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Science. 368 (6492), 754-759 (2020).
