Denna forskning beskriver två tekniker för att isolera rikligt med neutrofila extracellulära fällor (NET) från råttbenmärg. Den ena metoden kombinerar ett kommersiellt neutrofilisoleringskit med densitetsgradientcentrifugering, medan den andra endast använder densitetsgradientcentrifugering. Båda metoderna ger funktionella NET som överträffar dem från neutrofiler i perifert blod.
Det primära syftet med denna forskning var att utveckla ett tillförlitligt och effektivt tillvägagångssätt för att isolera neutrofila extracellulära fällor (NET) från råttbenmärg. Detta försök uppstod på grund av begränsningar i samband med den traditionella metoden att extrahera NET från perifert blod, främst på grund av bristen på tillgängliga neutrofiler för isolering. Studien avslöjade två distinkta metoder för att erhålla neutrofiler från råttor från benmärg: en strömlinjeformad enstegsprocedur som gav tillfredsställande reningsnivåer och en mer tidskrävande tvåstegsprocess som uppvisade förbättrad reningseffektivitet. Viktigt är att båda teknikerna gav en betydande mängd livskraftiga neutrofiler, mellan 50 och 100 miljoner per råtta. Denna effektivitet speglade de resultat som erhölls genom att isolera neutrofiler från både humana och murina källor. Signifikant är att neutrofiler som härrör från benmärg från råtta uppvisade jämförbar förmåga att utsöndra NET jämfört med neutrofiler erhållna från perifert blod. Den benmärgsbaserade metoden gav dock genomgående betydligt större mängder av både neutrofiler och NET. Detta tillvägagångssätt visade potentialen att erhålla betydligt större mängder av dessa cellulära komponenter för ytterligare nedströmsapplikationer. Noterbart är att dessa isolerade NET och neutrofiler är lovande för en rad tillämpningar, som spänner över områdena inflammation, infektion och autoimmuna sjukdomar.
Neutrofiler utgör en kritisk undergrupp av leukocyter som spelar en central roll i det medfödda immunsvaret. De karakteriseras av flerflikiga kärnor och granuler som innehåller olika proteaser och antimikrobiella peptider1. Neutrofiler fungerar främst genom degranulering, fagocytos och bildning av NET. Observationen av NET gjordes först av Takei et al. 1996 under ett experiment där neutrofiler stimulerades med forbolmyristatacetat (PMA)2. Därefter myntades processen för NET-bildning “NETosis” av Brinkmann et al.3 2004. Deras forskning belyste ytterligare den avgörande roll som NET spelar i neutrofilmedierade antimikrobiella svar. NET är nätliknande strukturer som består av kromatin, histoner och antimikrobiella proteiner som frisätts från aktiverade neutrofiler som svar på infektiösa och inflammatoriska stimuli. NET kan immobilisera och döda invaderande patogener genom att fånga dem och utsätta dem för en hög koncentration av antimikrobiella peptider och proteaser 1,3. Dessutom bidrar NET till eliminering av apoptotiska celler och deltar i inflammationsupplösning. Nyligen genomförda studier tyder också på att en överdriven bildning av NET eller försämrad NET-nedbrytning kan leda till vävnadsskador, autoimmuna sjukdomar, trombogenes och försämrad revaskularisering 4,5,6,7,8,9,10.
Den patogena rollen av NET vid okontrollerad fibros efter hjärtinfarkt och bildandet av ventrikulära aneurysm har påvisats genom expansion av perivaskulär fibros 4,11. Hjärtinfarktmodellen och isoleringen av neutrofiler från benmärg hos möss är båda väletablerade. Polymorfonukleära (PMN) leukocyter, en typ av vita blodkroppar som finns rikligt i humant blod, fungerar som en utmärkt källa för att isolera humana neutrofiler. Denna metod eliminerar behovet av att skörda benmärg, vilket ökar säkerheten och effektiviteten.
NET spelar också en roll vid förmaksflimmer i samband med hjärtombyggnad. Stora djur som hundar och grisar användes dock för att modellera förmaksflimmer, eftersom möss saknar ett förmak som är tillräckligt stort för att etablera en återinträdescykel eller AF-modellen, såvida inte specifika jonkanaler eller signalvägar slås ner eller slås ut12. Även om det är möjligt att inducera förmaksflimmer hos råttor och isolera neutrofiler från perifert blod från råttor som tidigare beskrivits, stötte forskarna på en begränsning där endast 2 x 105-5 x 105 neutrofiler kunde isoleras från perifert blod (10 ml per råtta). Att extrahera tillräckligt med NET vid varje tidpunkt krävde cirka 10-25 råttor (5 x 106 neutrofiler totalt), vilket resulterade i en tidskrävande, dyr och ofta lågavkastande process13. I detta avseende presenterar Li He och kollegor en benmärgsorienterad strategi för att få adekvata NET från råttor14. I sin artikel ger de en omfattande beskrivning av isolering av neutrofiler från benmärg från råtta och jämför NET-sekretionsförmågan hos perifera neutrofiler och benmärgsneutrofiler hos råttor. De två metoder som beskrivs tillgodoser olika experimentella mål, som båda resulterar i tillräckliga mängder neutrofiler från råttbenmärg samtidigt som antalet råttor som krävs minskar. Tvåstegsisoleringsmetoden visade överlägsen rening av neutrofila granulocyter, medan enstegsmetoden visade sig vara tidseffektiv med acceptabla reningsnivåer. Dessutom jämförde forskarna NETosis och NET-bildning mellan neutrofiler i benmärg hos råttor och deras perifera motsvarigheter, och fann samma styrka som PMN. Dessa fynd bidrar i hög grad till neutrofilrelaterade studier av förmaksflimmer och understryker vikten av att flexibelt välja olika källor för neutrofilisolering i olika försöksdjur med olika neutrofilfördelningar.
Isolering av neutrofiler utgör ett avgörande steg i studien av NETosis, där valet av en lämplig isoleringsmetod är av största vikt för att uppnå tillförlitliga resultat. En viktig faktor att väga in är förekomsten av lymfocytkontamination under isoleringen. Att ta itu med denna utmaning är särskilt viktigt när man isolerar neutrofiler från råttor från benmärg. Trots det distinkta densitetsintervallet för neutrofiler (1,0814-1,0919, med en topp på 1,0919) jämfört med lymfocyter (1,0337-1,0765, med e…
The authors have nothing to disclose.
Finansiering: Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 82004154, 81900311, 82100336 och 81970345).
A488-conjugated donkey antirabbit IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32790 | |
A594-conjugated donkey anti-mouse IgG(H + L) | Invitrogen, USA | A32744 | |
A594-conjugated goat anti-Mouse IgG1 | Invitrogen, USA | A21125 | |
Anti-rat myeloperoxidase | Abcam, England | ab134132 | |
Anti-rat neutrophil elastase | Abcam, England | ab21595 | |
Celigo Image Cytometer | Nexelom, USA | 200-BFFL-5C | |
DNase I | Sigma, USA | 10104159001 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco, USA | 10099141C | |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco, USA | C14175500BT | |
Hoechst | Thermofisher, USA | 33342 | |
Isoflurane | RWD, China | R510-22-10 | |
Mowiol | Sigma, USA | 81381 | |
Normal Donkey Serum | Solarbio, China | SL050 | |
Paraformaldehyde | biosharp, China | BL539A | |
Penicillin-streptomycin | Hyclone, USA | SV30010 | |
Percoll | GE, USA | P8370-1L | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma, USA | P1585 | |
Picogreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen, USA | P11496 | |
Rat neutrophil isolation kit | Solarbio, China | P9200 | |
Red blood cell lysis buffer | Solarbio, China | R1010 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media | Hyclone, USA | SH30809.01B | |
RWD Universal Animal Anesthesia Machine | RWD, China | R500 | |
Sprague Dawley (SD) rats | Dashuo, China | ||
SytoxGreen | Thermofisher, USA | S7020 | |
Tris-EDTA (TE) buffer | Solarbio, China | T1120 | |
Triton-X-100 | Biofroxx, German | 1139ML100 |