骨髄由来マクロファージ由来の微小細胞外小胞ペプチドの同定
Summary
このプロトコルは、示差超遠心によってマクロファージから小さな細胞外小胞を単離し、質量分析による同定のためにペプチドームを抽出する手順を説明しています。
Abstract
小さな細胞外小胞(sEV)は、通常、多胞小体(MVB)のエキソサイトーシスによって分泌されます。直径<200nmのこれらのナノベシクルは、さまざまな体液中に存在する。これらのsEVは、タンパク質、DNA、RNA、代謝物などの貨物を介して、遺伝子の転写と翻訳、細胞の増殖と生存、免疫と炎症などのさまざまな生物学的プロセスを調節します。現在、sEVの絶縁のためにさまざまな技術が開発されています。その中で、超遠心分離ベースの方法はゴールドスタンダードと見なされており、sEVの分離に広く使用されています。ペプチドは、長さが50アミノ酸未満の天然の生体高分子です。これらのペプチドは、ホルモン、神経伝達物質、細胞成長因子などの生物学的活性を有する様々な生物学的プロセスに関与している。ペプチドドームは、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)によって特定の生物学的サンプル中の内因性ペプチドを体系的に分析することを目的としています。ここでは、示差超遠心法によってsEVを単離するプロトコルを導入し、LC-MS/MSによる同定のためにペプチドドームを抽出しました。この方法により、骨髄由来マクロファージから数百のsEV由来ペプチドが同定されました。
Introduction
直径200nm未満の小さな細胞外小胞(sEV)は、ほぼすべての種類の体液に存在し、尿、汗、涙、脳脊髄液、羊水など、あらゆる種類の細胞から分泌されます1。当初、sEVは細胞廃棄物を処分するための容器と見なされていたため、その後の10年間で最小限の研究につながりました2。最近、sEVに特定のタンパク質、脂質、核酸、およびその他の代謝物が含まれていることを示す証拠が増えています。これらの分子は標的細胞3に輸送され、細胞間コミュニケーションに寄与し、それを介して組織修復、血管新生、免疫4および炎症5,6、腫瘍の発生および転移7,8,9などの様々な生物学的プロセスに関与する。
sEVの研究を容易にするには、複雑なサンプルからsEVを分離することが不可欠です。sEVの密度、粒子サイズ、表面マーカータンパク質など、sEVの物理的および化学的特性に基づいて、さまざまなsEV分離方法が開発されています。これらの技術には、超遠心ベースの方法、粒子サイズベースの方法、イムノアフィニティー捕捉ベースの方法、sEV沈殿ベースの方法、およびマイクロフルイディクスベースの方法が含まれる10、11、12。これらの技術の中で、超遠心分離ベースの方法は、sEV分離のゴールドスタンダードとして広く認識されており、最も一般的に使用されている技術です13。
ますます多くの証拠が、様々な生物のペプチド中に未発見の生物学的に活性なペプチドが多数存在することを示唆している。これらのペプチドは、成長、発達、ストレス応答14、15、およびシグナル伝達16を調節することにより、多数の生理学的プロセスに大きく貢献します。sEVのペプチドドームの目的は、これらのsEVが担うペプチドを明らかにし、その生物学的機能の手がかりを提供することです。ここでは、示差超遠心によってsEVを単離し、続いてこれらのsEVからペプチドを抽出してペプチドドームをさらに分析するプロトコルを紹介します。
Protocol
Representative Results
Discussion
sEVの機能を調べる際には、潜在的な汚染を避けるために、複雑な生物学的サンプルから高純度のsEVを得ることが不可欠です。sEVの分離にはさまざまな方法が開発されており13、これらの方法の中で、示差超遠心ベースの方法は比較的高い純度のsEVを示しています。本研究では、200 mLの細胞上清を6時間回収し、示差超遠心により約200〜300 μgのsEVが得られた。ただし、超遠心分…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国自然科学基金会(3157270)からの助成金によって支援されました。iBMDMを提供してくださったFeng Shao博士(中国国立生物科学研究所)に感謝します。
Materials
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
Referências
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