Enfoque simplificado de imágenes intravitales para la monitorización a largo plazo de la dinámica del tejido epitelial en un microscopio confocal invertido
Summary
El protocolo presenta una nueva herramienta para simplificar la obtención de imágenes intravitales mediante microscopía confocal invertida.
Abstract
Comprender los comportamientos normales y aberrantes de las células in vivo es necesario para desarrollar intervenciones clínicas que frustren el inicio y la progresión de la enfermedad. Por lo tanto, es fundamental optimizar los enfoques de imagen que faciliten la observación de la dinámica celular in situ, donde la estructura y la composición de los tejidos permanecen inalteradas. La epidermis es la barrera más externa del cuerpo, así como la fuente de los cánceres humanos más prevalentes, a saber, los carcinomas cutáneos de piel. La accesibilidad del tejido cutáneo presenta una oportunidad única para monitorizar el comportamiento de las células epiteliales y dérmicas en animales intactos mediante microscopía intravital no invasiva. Sin embargo, este sofisticado enfoque de imagen se ha logrado principalmente utilizando microscopios multifotónicos verticales, que representan una barrera de entrada significativa para la mayoría de los investigadores. Este estudio presenta un inserto de platina de microscopio impreso en 3D diseñado a medida y adecuado para su uso con microscopios confocales invertidos, lo que agiliza la obtención de imágenes intravitales a largo plazo de la piel del oído en ratones transgénicos vivos. Creemos que esta versátil invención, que puede personalizarse para adaptarse a la marca y el modelo de microscopio invertido de elección y adaptarse a la obtención de imágenes de sistemas de órganos adicionales, resultará invaluable para la comunidad de investigación científica en general al mejorar significativamente la accesibilidad de la microscopía intravital. Este avance tecnológico es fundamental para reforzar nuestra comprensión de la dinámica de las células vivas en contextos normales y de enfermedad.
Introduction
La microscopía intravital es una poderosa herramienta que permite el monitoreo de los comportamientos celulares en sus ambientes in vivo no perturbados. Este método único ha proporcionado información clave sobre el funcionamiento interno de los complejos sistemas de órganos de los mamíferos, incluidos el pulmón1, el cerebro2, el hígado3, la glándula mamaria4, el intestino5 y la piel6. Además, este enfoque ha revelado alteraciones del comportamiento celular durante el desarrollo tumoral7, la cicatrización de heridas8,9, la inflamación10 y otras patologías diversas in situ. En este estudio, nos centramos en mejorar la accesibilidad de la microscopía intravital para obtener imágenes de la dinámica epitelial y estromal en vivo en la piel intacta del ratón. La comprensión del comportamiento celular en la piel de mamíferos es de gran importancia clínica debido a la notable capacidad regenerativa y tumorigénica de este tejido.
La obtención de imágenes intravitales en ratones se ha realizado principalmente utilizando microscopios multifotónicos verticales debido a su capacidad para proporcionar imágenes de alta resolución a profundidades tisulares >100 μm11,12. Sin embargo, estos instrumentos carecen de la versatilidad y la accesibilidad más general de los microscopios confocales invertidos, que son más fáciles de usar y rentables, proporcionan la capacidad de obtener imágenes de células cultivadas, no requieren oscuridad completa durante la adquisición de imágenes y, en general, son más seguros, entre otras ventajas notables13,14. En este estudio, presentamos una nueva herramienta que mejora significativamente la accesibilidad a las imágenes intravitales mediante la adaptación de este enfoque para microscopios confocales invertidos.
Aquí, presentamos un diseño de inserto de platina personalizado impreso en 3D que incorpora varias características clave para facilitar la obtención de imágenes intravitales estables y a largo plazo de la piel del oído de ratón en un microscopio confocal invertido (Figura 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4 y Figura 5). Estas características especializadas incluyen un orificio de objetivo desplazado que permite que todo el cuerpo de un ratón adulto quede completamente plano durante la obtención de imágenes. Esto minimiza la interferencia vibratoria de los movimientos del cuerpo del ratón en las imágenes y elimina la necesidad de administrar ketamina y xilacina para amortiguar la respiración, una práctica que a menudo se combina con las imágenes intravitales6. Además, los soportes de las esquinas del inserto colocan correctamente un cono de nariz de isoflurano para alinearlo con la cara del ratón, un clip metálico para la oreja inmoviliza la oreja del ratón a un disco de cubreobjetos hecho a medida, y una placa térmica de biorretroalimentación de circuito cerrado desmontable opcional se encuentra al ras del inserto para soportar la temperatura corporal del ratón durante las largas sesiones de imágenes. El disco de cubreobjetos personalizado, que proporciona una superficie plana esencial para que la cabeza y la oreja del ratón queden planas, se generó en un taller mecánico quitando las paredes de una placa de cultivo celular genérica que contenía cubreobjetos. El uso de una lente de inmersión en aceite de silicona de 40x (apertura numérica de 1,25 [N.A.], distancia de trabajo de 0,3 mm) junto con el disco de cubreobjetos y el inserto de platina personalizado proporciona imágenes de alta resolución a >50 μm de profundidad en la dermis del oído.
Para probar la funcionalidad de este nuevo inserto de platina de microscopio invertido, capturamos pilas z que abarcan todas las capas epiteliales epidérmicas durante un curso de tiempo de 3 h en el oído de un ratón adulto transgénico vivo K14-H2B-mCherry15 (los núcleos epiteliales de esta línea de ratones contienen una etiqueta fluorescente roja) (Figura 6A-A‘). También capturamos pilas z que abarcan varias capas de fibroblastos dentro de la dermis de la piel durante un curso de tiempo de 3 h en el oído de un Pdgfra-rtTA16 transgénico vivo; Ratón adulto pTRE-H2B-GFP17 (los núcleos de fibroblastos de esta línea de ratones contienen una etiqueta fluorescente verde tras la inducción de doxiciclina) (Figura 6B-D‘). Nuestros datos de alta resolución demuestran una estabilidad constante por falta de deriva en los planos x, y y z, lo que demuestra la eficacia de esta nueva herramienta de imágenes intravitales para su uso en microscopios invertidos. Es importante destacar que las dimensiones de este inserto de platina impreso en 3D se pueden ajustar, como se describe en el Archivo Suplementario 1, el Archivo Suplementario 2 y el Archivo Suplementario 3, para adaptarse a cualquier microscopio invertido, y la posición de la abertura del objetivo se puede mover a ubicaciones alternativas dentro del inserto para adaptarse mejor a la obtención de imágenes de un tejido particular y/o modelo animal de interés. Por lo tanto, esta invención puede capacitar a los laboratorios individuales, o a los investigadores con acceso confocal a las instalaciones básicas, para adaptar esta herramienta a sus necesidades únicas de imágenes intravitales, agilizando así la evaluación de la biología celular in vivo diversa.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este estudio, presentamos una nueva herramienta que facilita la obtención de imágenes intravitales estables y a largo plazo de epitelios de piel de ratón intactos en microscopios confocales invertidos. Este invento está hecho de PLA, que es el material imprimible en 3D más común y económico; todos los costes internos de impresión 3D de este inserto ascienden a 5 < dólares. Las dos piezas de inserción separadas (Figura 1, Archivo Suplementario 1 y Lima Su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Valentina Greco por los ratones K14-mCherry-H2B. Agradecemos al Taller de Máquinas del Departamento de Física de la Universidad de Emory por generar los discos de cubreobjetos de vidrio. Este trabajo fue financiado por el Premio al Desarrollo Profesional #IK2 BX005370 del Departamento de Asuntos de Veteranos de EE. UU. BLRD Service to LS, los premios NIH RF1-AG079269 y R56-AG072473 a MJMR, y el premio I3 Emory SOM/GT Computational and Data Analysis Award a MJMR.
Materials
| 3D Printer | Qudi Tech | i-Fast | 3D prints using PLA material |
| 40x 1.25NA silicone objective lens | Nikon | ||
| AxR Laser Scanning Confocal Microscope | Nikon | ||
| Cotton Tipped Swab | VWR | 76337-046 | Cream/ointment application |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | Induces GFP labeling of fibroblast nuclei in Pdgfra-rtTA; pTRE-H2B-GFP mice |
| Flathead Screwdriver (2.5 mm) | Affiix insert to microscope stage | ||
| Flathead Screws x 4 (#6-32) | Nikon | Screw insert into microscope stage | |
| Glass Bottom Culture Dish | chemglass Life Sciences | CLS-1811-002 | Modified by removing walls of dish for use as coverslip disk compatible with live insert; 35 mm wide disk contains 20 mm wide glass coverslip; dish walls were removed by machine shop |
| Heat Plate controller | Physitemp | TCAT-2LV | Animal Temperature Controller – Low Voltage; anal prob attachment for mouse body temperature monitoring |
| Hex Wrench (1.5 mm) | For M3 setscrew adjustments | ||
| Hex Wrench (2.5 mm) | Adjust tension on metal ear clip | ||
| Intravital Imaging Insert | |||
| Isoflurane | Med-Vet International | HPA030782-100uL | Mouse anesthesia |
| Labeling Tape (or Scotch Tape) | VWR | 10127-458 | Alternative to metal ear clip to immobilize ear to coverslip |
| Metal fastener | used as ear clip | ||
| Mouse: C57BL/6-Pdgfraem1(rtTA)Xsun/J | The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:034459 | Fibrroblast-specific promoter driving doxycycline-inducible rtTA expression |
| Mouse: K14-H2BPAmCherry | Courtesy of Dr. Valentina Greco at Yale University | Labels epidermal epithelial cell nuclei with mCherry; referred to in text as "K14-H2B-mCherry" | |
| Mouse: pTRE-H2B-GFP: STOCK Tg(tetO-HIST1H2BJ/GFP)47Efu/J |
The Jackson Laboratory | RRID: IMSR_JAX:005104 | Labels fibroblast nuclei with GFP when combined with Pdgfra-rtTA and induced with doxycycline |
| Multipurpose Sealing Wrap | Glad | Enhance mouse warmth | |
| Optixcare | VWR | MSPP-078932779 | Eye lubricant |
| Set screws x 3 (M3; 6 mm) | Thorlabs | SS3M6 | Attachment for heatplate module |
| Silicone Immersion Oil | Applied to 40x silicone objective | ||
| Small Animal Heating Plate | Physitemp | HP-4M | Provides heat to animal |
| Somnoflow Low-Flow Electronic Vaporizer | Kent Scientific | SF-01 | Mouse anesthesia |
| Vacuum Grease | Flinn Scientific | AP1095 | Seals coverslip disk to insert |
| Veet | hair removal | ||
| Water circulating heat pad | Stryker Medical | TP700 | for mouse revival post-imaging |
Referências
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