Aqui, um sistema é relatado para estudar os comportamentos coletivos de nematoides através de cultivá-los a granel usando meio ágar ração para cães. Este sistema permite aos pesquisadores propagar um grande número de vermes dauer e pode ser aplicado a Caenorhabditis elegans e outras espécies relacionadas.
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Artigo de método
O cultivo em larga escala de nematoides para estudar seus comportamentos coletivos
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os animais exibem comportamentos coletivos dinâmicos, como observado em bandos de aves, cardumes de peixes e multidões de humanos. Os comportamentos coletivos dos animais têm sido investigados nos campos da biologia e da física. Em laboratório, os pesquisadores usaram vários animais-modelo, como a mosca-da-fruta e o peixe-zebra, por aproximadamente um século, mas continua sendo um grande desafio estudar o comportamento coletivo complexo em grande escala orquestrado por esses animais-modelo geneticamente tratáveis. Este artigo apresenta um protocolo para criar um sistema experimental de comportamentos coletivos em Caenorhabditis elegans. Os vermes propagados sobem na tampa da placa de Petri e apresentam comportamento de enxame coletivo. O sistema também controla as interações e comportamentos dos vermes, alterando a umidade e a estimulação luminosa. Esse sistema nos permite examinar os mecanismos subjacentes aos comportamentos coletivos, alterando as condições ambientais e examinando os efeitos da locomoção em nível individual sobre os comportamentos coletivos usando mutantes. Assim, o sistema é útil para futuras pesquisas em física e biologia.
Introdução
Tanto os não-cientistas quanto os cientistas são fascinados pelos comportamentos coletivos dos animais, como em bandos de pássaros e cardumes de peixes. Comportamentos coletivos têm sido analisados em uma ampla gama de campos, incluindo física, biologia, matemática e robótica. Em particular, a física da matéria ativa é um campo de pesquisa crescente que se concentra em sistemas compostos por elementos autoproppelidos, isto é, sistemas dissipativos, como bandos de aves, cardumes de peixes, biofilmes de bactérias móveis, citoesqueletos compostos por moléculas ativas e grupos de coloides autoproppelidos. A teoria da física da matéria ativa sustenta que, por mais complexo....
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Protocolo
1. Preparação de vermes
NOTA: Preparar as cepas selvagem N2 Bristol12 e ZX899 (lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP])13 para a observação de comportamentos coletivos e experimentos optogenéticos, respectivamente. Mantenha a cepa ZX899 em condições escuras.
- Depositar quatro vermes adultos bem alimentados em placa de 60 mm contendo 14 mL de meio de cultura de nematoide (NGM) com ágar e semeado com E. coli OP5012.
- Cultivar vermes F1 até a fome na placa NGM a 23 °C por 7 dias. O rendimento de vermes F1 é d....
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Resultados
Aqui, vermes dauer selvagens foram usados para observações de comportamento coletivo. As minhocas foram cultivadas a 23 °C por aproximadamente 10-14 dias e subiram até a superfície interna da tampa de uma placa média de DFA. No dia do experimento, apenas a pálpebra foi transferida para uma nova placa de NGM sem E. coli e meio DFA. O fundo dessa placa de Petri foi inicialmente mantido a 23 °C usando o sistema Peltier e, em seguida, sua temperatura foi aumentada para 26 °C. Um filme foi feito ao microscópio.
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Discussão
Neste estudo, mostramos um protocolo para a preparação de um sistema para o comportamento coletivo em larga escala de C. elegans em laboratório. O método baseado em DFA foi originalmente estabelecido com Caenorhabditis japonica14 e Neoaplectana carpocapsae Weiser15, ambos animais não modelo. No entanto, esse método não foi aplicado para investigar comportamentos coletivos. O C. elegans é um animal modelo geneticamente tratável11,12.
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Agradecemos ao Centro de Genética Caenorhabditis pelo fornecimento das cepas utilizadas neste estudo. Esta publicação foi apoiada pelo projeto JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (grant number JP21H02532), JSPS KAKENHI Grant-in-Aid on the Innovative Areas "Science of Soft Robot" (grant number JP18H05474), JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Transformative Research Areas B (grant number JP23H03845), the PRIME from Japan Agency for Medical Research and Development (grant number JP22gm6110022h9904), JST-Mirai Program (grant number JPMJMI22G3), e Programa JST-FOREST (bolsa número JPMJFR214R).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Escherichia coli e C. elegans cepas | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Alimento para C. elegans. Uracila auxotrófica. E. coli B. |
| lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP] | author | ZX899 | lite-1(ce314) mutante que transporta os genes que expressam ChR2 e RFP sob o controle do mec-4 e unc-122 promoter, respectivamente |
| N2 Bristrol | Caenorhabditis Genetics Center | Linhagem de tipo selvagem C. elegans | |
| Para cultivo de vermes | |||
| Agar purificado, pó | Nakarai tesque | 01162-15 | Para preparação de placas NGM |
| All-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Para optogenética |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | Para preparação de placas NGM |
| Cloreto de cálcio | Wako | 036-00485 | Para preparação de placas NGM |
| Colesterol | Wako | 034-03002 | Para preparação de placas NGM |
| di-Fotássio hidrogenofosfato | Nakarai tesque | 28727-95 | Para preparação de placas NGM |
| Ração para cães | Nihon Pet Food | VITA-ONE | Para preparação de ração para cães ágar médio |
| LB caldo, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | Para cultura de E. coli OP50 |
| Sulfato de magnésio anidro | TGI | M1890 | Para preparação de placas NGM |
| Placas de Petri (60 mm) | Nunc | 150270 | Para preparação de placas NGM |
| Dihidrogenofosfato | potássio Nakarai tesque | 28720-65 | Para preparação de placas NGM |
| Cloreto de sódio | Nakarai tesque | 31320-05 | Para preparação de placas NGM |
| Observation | |||
| Computer | CT solution | CS6229 | Windows10 Pro com CPU Intel Xeon Gold 6238R e 768 GB de RAM |
| CMOS Camera | Hamamatsu photonics | ORCA-Lightning C14120-20P | Para aquisição de dados |
| Câmera CMOS | Olympus | DP74 | Para aquisição de dados |
| Microscópio com conjunto SZX-MGFP | Olympus | MVX10 | Para aquisição de dados |
| x2 Lente objetiva | Olympus | MV PLAPO 2XC | Distância de trabalho 20 mm e abertura numérica 0,5 |
| Controle do obturador | |||
| Obturador | OptoSigma | BSH2-RIX | Para controlar o padrão temporal de iluminação de luz |
| Controlador de obturador | OptoSigma | SSH-C2B-A | Para controlar o padrão temporal de iluminação de luz |
| Controle de temperatura | |||
| Unidade controladora de temperatura Peltier | VICS | WLVPU-30 | Para controlar a umidade dentro de uma placa de Petri |
| CONTROLADOR UNI-THEMO | Ampere | UTC-100 | Para controlar a umidade dentro de uma placa de Petri |
| Software de aquisição de dados | |||
| HCImage | Fotônica Hamamatsu | Para aquisição |
Referências
- Vicsek, T., Czirók, A., Ben-Jacob, E., Cohen, I., Shochet, O. Novel type of phase transition in a system of self-driven particles. Physical Review Letters. 75 (6), 1226-1229 (1995).
- Nishiguchi, D., Nagai, K. H., Chaté, H., Sano, M. Lon....
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Reimpressões e permissões
