מהדק היפרגליקמי ומהדק היפוגליקמי בעכברים מודעים
Summary
מהדק היפרגליקמי משמש למדידת שחרור אינסולין עם ריכוז גלוקוז גבוה יותר בדם. מהדק היפוגליקמי מיועד למדידת ייצור גלוקוז המושרה על ידי תגובות נגד ויסות. שתי השיטות משתמשות באותו הליך כירורגי. כאן, אנו מציגים טכניקת מהדק להערכת מטבוליזם גלוקוז מערכתי.
Abstract
סוכרת (DM) נגרמת על ידי שחרור אינסולין לא מספיק מתאי β הלבלב (סוג 1 DM) ורגישות לאינסולין בשרירים, בכבד וברקמות השומן (סוג 2 DM). הזרקת אינסולין מטפלת בחולי DM אך מובילה להיפוגליקמיה כתופעת לוואי. קורטיזול וקטכולאמינים משתחררים כדי להפעיל את ייצור הגלוקוז מהכבד כדי לשחזר היפוגליקמיה, הנקראת תגובות נגד ויסות (CRR). במחקר DM באמצעות מודלים של מכרסמים, בדיקות סבילות לגלוקוז והזרקת 2-דאוקסי-גלוקוז משמשות למדידת שחרור אינסולין ו-CRR, בהתאמה. עם זאת, ריכוזי הגלוקוז בדם משתנים באופן מתמשך במהלך ניסויים, מה שגורם לקשיים בהערכת שחרור אינסולין נטו ו- CRR. מאמר זה מתאר שיטה שבה גלוקוז בדם נשמר על 250 מ”ג / ד”ל או 50 מ”ג / ד”ל בעכברים מודעים כדי להשוות את שחרור הורמוני אינסולין ו- CRR, בהתאמה.
צינורות פוליאתילן מושתלים בעורק התרדמה ובווריד הצוואר של העכברים, והעכברים מורשים להתאושש מהניתוח. צינור הוורידים הצווארי מחובר למזרק המילטון עם משאבת מזרק כדי לאפשר עירוי אינסולין או גלוקוז בקצב קבוע ומשתנה. צינורות עורק התרדמה מיועדים לאיסוף דם. עבור מהדק היפרגליקמי, 30% גלוקוז הוא חדורים לתוך הווריד, ואת רמות הגלוקוז בדם נמדדים מן הדם העורקי כל 5 דקות או 10 דקות. שיעור העירוי של 30% גלוקוז מוגבר עד רמת הגלוקוז בדם הופך 250 מ”ג / ד”ל. הדם נאסף כדי למדוד את ריכוזי האינסולין. עבור מהדק היפוגליקמי, אינסולין של 10 mU / kg / min מוחדר יחד עם 30% גלוקוז, ששיעור העירוי שלו משתנה כדי לשמור על 50 מ”ג / ד”ל של רמת הגלוקוז בדם. הדם נאסף כדי למדוד הורמונים נגד ויסות כאשר גם עירוי גלוקוז וגם גלוקוז בדם מגיעים למצב יציב. גם מלחציים היפרגליקמיים וגם מהדקים היפוגליקמיים יש את אותו הליך כירורגי ומערך ניסיוני. לפיכך, שיטה זו שימושית עבור חוקרים של מטבוליזם גלוקוז מערכתי.
Introduction
גלוקוז הוא מקור אנרגיה חשוב לתאים, ומחסור בגלוקוז יכול להוביל למגוון תסמינים וסיבוכים. במקרה של גלוקוז נמוך (היפוגליקמיה, בדרך כלל פחות מ 70 מ”ג / ד”ל ברמת גלוקוז בדם בצום, אבל לא צריך להיקבע על ידי ערך יחיד1), הסימפטומים הנפוצים ביותר כוללים חולשה, בלבול, הזעה, וכאבי ראש. זה יכול גם לשבש את תפקוד המוח ולהגדיל את הסיכון לאירועים קרדיווסקולריים ותמותה2. לעומת זאת, היפרגליקמיה היא מצב רפואי שבו ריכוז הגלוקוז בפלזמה עולה על רמות נורמליות (בדרך כלל > 126 מ”ג / ד”ל ברמת גלוקוז בדם בצוםרמה 3). זה יכול להתרחש אצל אנשים עם סוכרת שיש להם או גירעון בייצור אינסולין או ניצול. היפרגליקמיה עלולה להוביל לחמצת קטוטית סוכרתית, המתרחשת כאשר הגוף אינו יכול להשתמש בגלוקוז לאנרגיה אלא במקום זאת מפרק חומצות שומן לדלק. המצב היפרגליקמי היפראוסמולרי גם מגביר תמותה4. היפרגליקמיה ארוכת טווח עלולה לגרום נזק לכלי דם, עצבים ואיברים, מה שמוביל להתפתחות של מספר סיבוכים כרוניים כגון מחלות לב וכלי דם, רטינופתיות ומחלות כליות. לכן, ריכוז הגלוקוז בדם חייב להישמר בטווח הדוק בין 100 מ”ג / ד”ל ו 120 מ”ג / ד”ל.
רמת הגלוקוז בדם מווסתת על-ידי האיזון בין קלט ופלט הגלוקוז במודל של תא אחד (איור 1A). קלט גלוקוז כולל גלוקוז נספג ממזון וייצור גלוקוז מהכבד, הכליות והמעי הדק. תפוקת הגלוקוז כוללת ספיגת גלוקוז ברקמות וסילוק גלוקוז מהכליות. הן כמות הקלט והפלט של גלוקוז מוסדרים על ידי הורמונים אנדוקריניים. לדוגמה, גלוקגון, קורטיקוסטרון וקטכולאמינים, הידועים כהורמונים נגד ויסות, משתחררים כאשר רמות הגלוקוז בדם יורדות5. הם מעוררים את התמוטטות הגליקוגן ואת הסינתזה של גלוקוז, בעיקר מן הכבד; תהליכים אלה ידועים בשם glycogenolysis ו gluconeogenesis, בהתאמה. היפרגליקמיה מגבירה את שחרור האינסולין מתאי β הלבלב ומעוררת ספיגת גלוקוז בשרירים, ברקמות השומן ובלב 6,7,8,9. פעילות גופנית מגבירה את ספיגת הגלוקוז שאינה תלויה באינסולין10. מערכת העצבים הסימפתטית מגבירה את ספיגת הגלוקוז בשרירים וברקמת השומן החומה 6,11. כדי למדוד את היכולת לווסת את חילוף החומרים של גלוקוז ברקמות היקפיות, חוקרים בדרך כלל משתמשים במבחן סבילות לגלוקוז (GTT) ובמבחן סבילות לאינסולין (ITT) (איור 1B,C). ב-GTT יש לקחת בחשבון שני גורמים: שחרור אינסולין ורגישות לאינסולין (איור 1B). עם זאת, עקומת ריכוז הגלוקוז במהלך הבדיקה של 120 דקות שונה בכל עכבר, מה שעשוי להשפיע על כמויות שונות של שחרור הורמונים. ב- ITT, גלוקוז בדם מווסת הן על ידי רגישות לאינסולין והן על ידי שחרור הורמונים נגד ויסות. לכן, קשה לקבוע את המשמעות המדויקת של חילוף החומרים של גלוקוז, שחרור אינסולין ורגישות לאינסולין ב- GTT ו- ITT, במצבים בהם רמות הגלוקוז בדם אינן קבועות.
כדי להתגבר על בעיות אלה, רצוי לשמור על רמת הגלוקוז בדם ברמה קבועה (או “מהדק”). במהדק היפרגליקמי, גלוקוז מוחדר לזרם הדם כדי להעלות את רמות הגלוקוז בדם לרמה מסוימת ולאחר מכן נשמר ברמה זו למשך תקופה של זמן. כמות הגלוקוז המוחדרת מותאמת על סמך מדידות של רמות הגלוקוז בדם כל 5-10 דקות כדי לשמור על מצב יציב. טכניקה זו שימושית במיוחד להבנת הפרמטרים של הפרשת אינסולין ברמת גלוקוז מהודקת. מהדק היפוגליקמי היא שיטה לשמירה על רמות גלוקוז נמוכות בדם על ידי עירוי אינסולין. גלוקוז הוא חדורים בקצב משתנה כדי לשמור על רמת גלוקוז ספציפית בדם. אם העכבר לא יכול להתאושש היפוגליקמיה, יותר גלוקוז צריך להיות חדורים.
למרות שישנם יתרונות רבים לביצוע מלחציים היפרגליקמיים והיפוגליקמיים, ההליכים הכירורגיים והניסיוניים נחשבים קשים מבחינה טכנית. לכן, קבוצות מחקר מעטות הצליחו לעשות זאת. מטרתנו הייתה לתאר שיטות אלה עבור חוקרים עם אילוצים פיננסיים וכוח אדם להתחיל ניסויים אלה בתקציב נמוך יותר.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת כאן היא פשוטה שניתן לעשות עם קצוות פיפטה, מזרקים, ופריטים אחרים הנמצאים במעבדות רגילות. למרות שייתכן שהחוקרים יצטרכו לרכוש צינורות ומשאבות נוספים, אין צורך בציוד יקר. לכן, פרוטוקול זה של צנתור ומהדק קל יותר להתחיל בהשוואה לדיווחים קודמים 12,13,14.…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי היוזמה המובילה לחוקרים צעירים מצטיינים (מבית MEXT); מענק סיוע למחקר מדעי (ב) (מענק מספר JP21H02352); הסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (AMED-RPIME, מספר מענק JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); קרן הזיכרון אואהארה; קרן אסטלס לחקר הפרעות מטבוליות; Suzuken Memorial Foundation, Akiyama Life Science Foundation ו-Narishige Neuroscience Research Foundation. אנו מודים גם לנור פרחאן אסגר, Ph.D, על עריכת טיוטה של כתב יד זה.
Materials
| Adhesive glue | Henkel AG & Co. KGaA | LOCTITE 454 | |
| ELISA kit (C-peptide) | Morinaga Institute of Bilogical Science Inc | M1304 | Mouse C-peptide ELISA Kit |
| ELISA kit (insulin) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 633-03411 | LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type) |
| Handy glucose meter | Nipro Co. | 11-777 | Free Style Freedom Lite |
| Insulin (100U/ml) | Eli Lilly & Co. | 428021014 | Humulin R (100U/ml) |
| Mouse | Japan SLC Inc. | C57BL/6NCrSlc | C57BL |
| Suture | Natsume seisakusho | C-23S-560 No.2 | Sterilized |
| Syringe Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Synthetic suture | VÖMEL | HR-17 | |
| Tubing1 | AS ONE Corporation | 9-869-01 | LABORAN(R) Silicone Tube |
| Tubing2 | Fisher Scientific | 427400 | BD Intramedic PE Tubing |
| Tubing3 | IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD. | size5 | Polyethylene tubing size5 |
Referências
- Seaquist, E. R., et al. Hypoglycemia and diabetes: A report of a workgroup of the american diabetes association and the endocrine society. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (5), 1845-1859 (2013).
- Amiel, S. A., et al. Hypoglycaemia, cardiovascular disease, and mortality in diabetes: epidemiology, pathogenesis, and management. The Lancet Diabetes and Endocrinology. 7 (5), 385-396 (2019).
- . Leanne Riley Mean fasting blood glucose Available from: https://www.who.int/data/gho/indicator-metadata-registry/imr-details/2380 (2022)
- Umpierrez, G., Korytkowski, M. Diabetic emergencies-ketoacidosis, hyperglycaemic hyperosmolar state and hypoglycaemia. Nature Reviews Endocrinology. 12 (4), 222-232 (2016).
- Sprague, J. E., Arbeláez, A. M. Glucose counterregulatory responses to hypoglycemia. Pediatric Endocrinology Reviews. 9 (1), 463-473 (2011).
- Toda, C., et al. Distinct effects of leptin and a melanocortin receptor agonist injected into medial hypothalamic nuclei on glucose uptake in peripheral tissues. Diabetes. 58 (12), 2757-2765 (2009).
- Toda, C., et al. Extracellular signal-regulated kinase in the ventromedial hypothalamus mediates leptin-Induced glucose uptake in red-type skeletal muscle. Diabetes. 62 (7), 2295-2307 (2013).
- Toda, C., Kim, J. D., Impellizzeri, D., Cuzzocrea, S., Liu, Z. -. W., Diano, S. UCP2 regulates mitochondrial fission and ventromedial nucleus control of glucose responsiveness. Cell. 164 (5), 872-883 (2016).
- Lee, M. L., et al. Prostaglandin in the ventromedial hypothalamus regulates peripheral glucose metabolism. Nature Communications. 12 (1), 2330 (2021).
- Jessen, N., Goodyear, L. J. Contraction signaling to glucose transport in skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 99 (1), 330-337 (2005).
- Shiuchi, T., et al. Induction of glucose uptake in skeletal muscle by central leptin is mediated by muscle β2-adrenergic receptor but not by AMPK. Scientific Reports. 7 (1), 15141 (2017).
- Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 57, e3188 (2011).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp in the conscious rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 48, e2432 (2010).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
- DeFronzo, R. A., Soman, V., Sherwin, R. S., Hendler, R., Felig, P. Insulin binding to monocytes and insulin action in human obesity, starvation, and refeeding. Journal of Clinical Investigation. 62 (1), 204-213 (1978).
- Czech, M. P. Insulin action and resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature Medicine. 23 (7), 804-814 (2017).
- Saisho, Y. β-cell dysfunction: Its critical role in prevention and management of type 2 diabetes. World Journal of Diabetes. 6 (1), 109 (2015).
- Mittendorfer, B., Patterson, B. W., Smith, G. I., Yoshino, M., Klein, S. β Cell function and plasma insulin clearance in people with obesity and different glycemic status. Journal of Clinical Investigation. 132 (3), 154068 (2022).
- Nchienzia, H., et al. Hedgehog interacting protein (Hhip) regulates insulin secretion in mice fed high fat diets. Scientific reports. 9 (1), 11183 (2019).
- Tomita, T., Doull, V., Pollock, H. G., Krizsan, D. Pancreatic islets of obese hyperglycemic mice (ob/ob). Pancreas. 7 (3), 367-375 (1992).
- Uchida, K., et al. Lack of TRPM2 impaired insulin secretion and glucose metabolisms in mice. Diabetes. 60 (1), 119-126 (2011).
- Zhu, Y. X., Zhou, Y. C., Zhang, Y., Sun, P., Chang, X. A., Han, X. Protocol for in vivo and ex vivo assessments of glucose-stimulated insulin secretion in mouse islet β cells. STAR Protocols. 2 (3), 100728 (2021).
- Moullé, V. S. Autonomic control of pancreatic beta cells: What is known on the regulation of insulin secretion and beta-cell proliferation in rodents and humans. Peptides. 148, 170709 (2022).
- Honzawa, N., Fujimoto, K., Kitamura, T. Cell autonomous dysfunction and insulin resistance in pancreatic α cells. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3699 (2019).
- Siddiqui, A., Madhu, S. V., Sharma, S. B., Desai, N. G. Endocrine stress responses and risk of type 2 diabetes mellitus. Stress. 18 (5), 498-506 (2015).
- Chan, O., Sherwin, R. Influence of VMH fuel sensing on hypoglycemic responses. Trends in Endocrinology & Metabolism. 24 (12), 616-624 (2013).
- Donovan, C. M., Watts, A. G. Peripheral and central glucose sensing in hypoglycemic detection. Physiology. 29 (5), 314-324 (2014).
- TeSlaa, T., et al. The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues. Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).
