意識のあるマウスにおける高血糖クランプと低血糖クランプ
Summary
高血糖クランプは、より高い血糖濃度を維持してインスリン放出を測定するために使用されます。血糖降下クランプは、逆調節反応によって誘発されるグルコース産生を測定するためのものです。どちらの方法も同じ外科的処置を使用します。ここでは、全身のグルコース代謝を評価するためのクランプ技術を紹介します。
Abstract
糖尿病(DM)は、膵臓β細胞からのインスリン放出不足(1型DM)と、筋肉、肝臓、脂肪組織におけるインスリン感受性(2型DM)によって引き起こされます。インスリン注射はDM患者を治療しますが、副作用として低血糖を引き起こします。コルチゾールとカテコールアミンが放出され、肝臓からのグルコース産生を活性化して、反調節反応(CRR)と呼ばれる低血糖を回復させます。げっ歯類モデルを用いたDM研究では、ブドウ糖負荷試験と2-デオキシグルコース注射を用いて、それぞれインスリン放出とCRRを測定します。しかし、血糖値は実験中に持続的に変化するため、正味のインスリン放出とCRRの評価が困難になります。本稿では、意識のあるマウスの血糖値を250mg/dLまたは50mg/dLに保ち、インスリンホルモンとCRRホルモンの放出をそれぞれ比較する方法について述べる。
マウスの頸動脈と頸静脈にポリエチレンチューブを埋め込み、マウスが手術から回復するのを待ちます。頸静脈チューブは、シリンジポンプでハミルトンシリンジに接続され、インスリンまたはグルコースを一定かつ可変の速度で注入することができます。頸動脈チューブは採血用です。高血糖クランプでは、30%のブドウ糖を静脈に注入し、5分または10分ごとに動脈血から血糖値を測定します。血糖値が250mg/dLになるまで、30%グルコースの注入速度を上げます。血液を採取してインスリン濃度を測定します。血糖降下クランプの場合、10 mU/kg/min のインスリンと 30% グルコースを注入し、その注入速度は 50 mg/dL の血糖値を維持します。血液は、ブドウ糖注入と血糖の両方が定常状態に達したときに、調節ホルモンを測定するために収集されます。高血糖クランプと低血糖クランプはどちらも、同じ外科的処置と実験設定を持っています。したがって、この方法は全身性グルコース代謝の研究者にとって有用である。
Introduction
ブドウ糖は細胞にとって重要なエネルギー源であり、ブドウ糖が不足するとさまざまな症状や合併症を引き起こす可能性があります。低血糖(低血糖、空腹時血糖値が70 mg / dL未満であるが、単一の値1で決定すべきではない)の場合、最も一般的な症状には、脱力感、錯乱、発汗、頭痛などがあります。また、脳機能を混乱させ、心血管イベントや死亡のリスクを高める可能性があります2。逆に、高血糖は血漿グルコース濃度が正常レベル(空腹時血糖値126で一般的に>3mg/dL)を超える病状です。これは、インスリンの産生または利用が不足している糖尿病患者に発生する可能性があります。高血糖は糖尿病性ケトアシドーシスを引き起こす可能性があり、これは体がブドウ糖をエネルギーとして使用できず、代わりに脂肪酸を燃料として分解するときに発生します。高血糖性高浸透圧状態も死亡率を増加させます4。長期的な高血糖は、血管、神経、臓器に損傷を与え、心血管疾患、網膜症、腎臓病などのいくつかの慢性合併症の発症につながる可能性があります。したがって、血糖値は100 mg / dLから120 mg / dLの間の狭い範囲に維持する必要があります。
血糖値は、1コンパートメントモデルにおけるグルコースのインプットとアウトプットのバランスによって調節されます(図1A)。グルコースインプットには、食物から吸収されたグルコースと、肝臓、腎臓、小腸からのグルコース産生が含まれます。グルコース産生は、組織へのグルコースの取り込みと腎臓からのグルコース処理で構成されます。ブドウ糖のインプット量とアウトプット量の両方が内分泌ホルモンによって調節されています。例えば、グルカゴン、コルチコステロン、カテコールアミンなどは、血糖値が下がると分泌されます5。それらは、主に肝臓からのグリコーゲンの分解およびグルコースの合成を刺激する。これらのプロセスは、それぞれグリコーゲン分解および糖新生として知られています。高血糖は、膵臓β細胞からのインスリン放出を増加させ、筋肉、脂肪組織、心臓へのグルコース取り込みを刺激します6,7,8,9。運動はインスリン非依存性グルコースの取り込みを増加させる10.交感神経系は、筋肉や褐色脂肪組織におけるグルコースの取り込みを増加させる6,11。末梢組織におけるグルコース代謝を調節する能力を測定するために、研究者は通常、ブドウ糖負荷試験(GTT)とインスリン負荷試験(ITT)を使用します(図1B、C)。GTTでは、インスリン放出とインスリン感受性の2つの要因を考慮する必要があります(図1B)。ただし、120分間の試験中のグルコース濃度曲線はマウスごとに異なり、ホルモン放出の量に影響を与える可能性があります。ITTでは、血糖値はインスリン感受性と調節ホルモンの放出の両方によって調節されます。したがって、血糖値が一定でない状況で、GTTおよびITTにおけるグルコース代謝、インスリン放出、およびインスリン感受性の正確な意味を決定することは困難です。
これらの問題を克服するためには、血糖値を一定レベルに保つこと(または「クランプ」)が望ましい。高血糖クランプでは、ブドウ糖を血流に注入して血糖値を特定のレベルまで上昇させ、その後、そのレベルに一定期間維持します。注入されたグルコースの量は、定常状態を維持するために、5〜10分ごとの血糖値の測定に基づいて調整されます。この手法は、クランプされたグルコースレベルでのインスリン分泌のパラメータを理解するのに特に有用です。血糖降下クランプは、インスリンを注入することで低血糖値を維持する方法です。グルコースは、特定の血糖値を維持するために可変速度で注入されます。マウスが低血糖から回復できない場合は、より多くのブドウ糖を注入する必要があります。.
高血糖および低血糖クランプを行うことには多くの利点がありますが、外科的および実験的手順は技術的に困難であると考えられています。そのため、それを実現できた研究グループはほとんどありません。私たちは、財政的および労働力的な制約のある研究者が、より低予算でこれらの実験を開始できるように、これらの方法を説明することを目指しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する方法は、ピペットチップやシリンジなど、通常の実験室にあるものを使ってできる簡単な方法です。研究者は追加のチューブやポンプを購入する必要があるかもしれませんが、高価な機器は必要ありません。したがって、カテーテル法とクランプのこのプロトコルは、以前のレポートと比較して開始が容易です12,13,14。<sup cl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、文部科学省の卓越若手研究者先導的研究機構の支援を受けて行われました。a 科学研究費補助金基盤研究(B)(課題番号JP21H02352)国立研究開発法人日本医療研究開発機構(AMED-RPIME、グラント番号JP21gm6510009h0001、JP22gm6510009h9901);公益財団法人上原記念財団アステラス代謝障害研究財団;公益財団法人スズケン記念財団、公益財団法人秋山生命科学財団、公益財団法人成重神経科学研究財団また、この原稿の草稿を編集してくれたNur Farehan Asgar博士にも感謝します。
Materials
| Adhesive glue | Henkel AG & Co. KGaA | LOCTITE 454 | |
| ELISA kit (C-peptide) | Morinaga Institute of Bilogical Science Inc | M1304 | Mouse C-peptide ELISA Kit |
| ELISA kit (insulin) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 633-03411 | LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type) |
| Handy glucose meter | Nipro Co. | 11-777 | Free Style Freedom Lite |
| Insulin (100U/ml) | Eli Lilly & Co. | 428021014 | Humulin R (100U/ml) |
| Mouse | Japan SLC Inc. | C57BL/6NCrSlc | C57BL |
| Suture | Natsume seisakusho | C-23S-560 No.2 | Sterilized |
| Syringe Pump | Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Synthetic suture | VÖMEL | HR-17 | |
| Tubing1 | AS ONE Corporation | 9-869-01 | LABORAN(R) Silicone Tube |
| Tubing2 | Fisher Scientific | 427400 | BD Intramedic PE Tubing |
| Tubing3 | IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD. | size5 | Polyethylene tubing size5 |
Referências
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