Tracciamento de novo dei lipidi mediante marcatura isotopica stabile LC-TIMS-TOF MS/MS
Summary
Qui viene presentato un metodo per lo screening delle strutture lipidiche attraverso la marcatura degli isotopi stabili utilizzando il loro tempo di ritenzione, mobilità e frammentazione.
Abstract
I lipidi sono molto diversi e piccoli cambiamenti nelle strutture e nella composizione dei lipidi possono avere effetti profondi sulle funzioni biologiche critiche. La marcatura degli isotopi stabili (SIL) offre diversi vantaggi per lo studio della distribuzione, della mobilizzazione e del metabolismo dei lipidi, nonché per la sintesi de novo dei lipidi. Il successo dell’implementazione della tecnica SIL richiede la rimozione delle interferenze dalle molecole endogene. Nel presente lavoro, descriviamo un protocollo analitico ad alto rendimento per lo screening di lipidi SIL da campioni biologici; Verranno mostrati esempi di identificazione de novo lipidica durante lo sviluppo delle ovaie delle zanzare. L’uso della cromatografia liquida complementare, della spettrometria di mobilità ionica intrappolata e della spettrometria di massa consente la separazione e l’assegnazione dei lipidi da un singolo campione in un’unica scansione (<1 ora). L'approccio descritto si avvale dei recenti sviluppi nell'acquisizione dipendente dai dati e nell'acquisizione indipendente dai dati, utilizzando l'accumulo parallelo nella trappola della mobilità seguita dalla frammentazione sequenziale e dalla dissociazione indotta dalla collisione. La misurazione del SIL a livello della catena degli acidi grassi rivela cambiamenti nella dinamica dei lipidi durante lo sviluppo ovarico delle zanzare. Le strutture dei lipidi de novo vengono assegnate con sicurezza in base al tempo di ritenzione, alla mobilità e al modello di frammentazione.
Introduction
Nell’analisi dei dati lipidici, la marcatura degli isotopi stabili (SIL) è un metodo efficace per valutare le vie metaboliche negli organismi viventi. In questo metodo, gli atomi all’interno di un analita sono sostituiti da isotopi stabili contenenti 13C o 2H. Questi isotopi sono ulteriormente incorporati nei precursori, che vengono successivamente incorporati negli acidi grassi, etichettando le aree in cui risiedono. Con questi isotopi, si è in grado di identificare la distribuzione e il metabolismo dei lipidi, in quanto contrasteranno con il fondo non marcato1. Le comuni piattaforme di spettrometria di massa non sono in grado di distinguere il segnale proveniente dalle molecole endogene2. Il successo di SIL richiede l’uso di strumenti analitici ad altissima risoluzione. La cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di mobilità ionica intrappolata ad alta risoluzione-frammentazione sequenziale ad accumulo parallelo-spettrometria di massa tandem a tempo di volo (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) consente la separazione di specie marcate e non marcate2. Il vantaggio dell’analisi LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS è che il segnale MS può essere filtrato in base al tempo di ritenzione (RT) e alla mobilità, riducendo così le potenziali interferenze delle molecole endogene, nonché la quantificazione e la separazione di tutte le specie desiderate2. Nella TIMS, uno ione viene prima tenuto fermo contro una fase gas-mobile e successivamente rilasciato in base alla sua mobilità. Ciò fornisce mobilogrammi ad alta risoluzione pur operando a una tensione inferiore rispetto alla precedente strumentazione IMS3. I mobilogrammi sono grafici della massa da caricare rispetto al tempo di deriva che possono essere utilizzati per distinguere tra i composti in base al loro tempo di deriva e alla quantità di sovrapposizione4.
Utilizzando una tecnica PASEF aggiuntiva, la velocità di sequenziamento viene notevolmente aumentata senza sacrificare la sensibilità5. La teoria PASEF prevede l’accumulo di ioni seguito dal loro rilascio sequenziale nell’ordine della loro mobilità. Questo viene fatto accumulando ioni in parallelo all’allineamento della loro mobilità. L’accumulo in questo modo impedisce la perdita di ioni. Inoltre, la selezione degli ioni precursori avviene contemporaneamente all’accumulo e al rilascio degli ioni. Con questo metodo, PASEF seleziona più precursori in serie durante ogni scansione TIMS, piuttosto che i singoli precursori per scansione tipici di uno strumento TIMS che non utilizza PASEF. Quando gli ioni precursori vengono accumulati contemporaneamente e rilasciati in picchi di 2 ms all’interno di una scansione TIMS di circa 100 ms per fotogramma, il segnale viene amplificato di oltre un ordine di grandezza, aumentando così il rapporto segnale/rumore3. L’aggiunta di PASEF al TIMS aumenta l’efficienza dell’MS/MS. Poiché il TIMS-PASEF è accoppiato con MS/MS, è possibile una frammentazione più efficiente. A differenza del rilevamento MS/MS convenzionale, il segnale del precursore viene compresso dal TIMS-PASEF e gli ioni frammento vengono rilevati contemporaneamente al tempo di eluizione TIMS e alla posizione di mobilità ionica del precursore3.
Quando si acquisiscono dati da uno spettrometro di massa, ci sono opzioni nella modalità di scansione desiderata. L’acquisizione dipendente dai dati (DDA) seleziona gli ioni precursori dalla scansione MS1 in base alla loro abbondanza, prima di frammentarli ed eseguire la scansione MS2. Questa modalità di scansione frammenta il maggior numero possibile di precursori. L’approccio DDA è mirato e i risultati dipenderanno dalla selezione ionica3. Tuttavia, DDA-PASEF ha spesso problemi nella riproducibilità tra le repliche. Sebbene DDA sia un ottimo strumento in un’analisi mirata, le miscele complesse hanno maggiori difficoltà nell’acquisizione dei dati6. Questo perché solo una piccola quantità di ioni può essere monitorata contemporaneamente3. L’acquisizione indipendente dai dati (DIA) è un metodo in cui le finestre preselezionate di m/z sono frammentate indipendentemente dalla loro intensità e tutte vengono scansionate entro l’intervallo7. Con questa modalità di scansione, intere nuvole di ioni vengono trasmesse dall’IMS allo spettrometro di massa3. Negli studi di proteomica ciò si traduce in una maggiore quantità di proteine quantificate in un arco di tempo più breve rispetto alla DDA. Inoltre, la DIA perde meno valori m/z rispetto alla DDA. Pertanto, questa alternativa ha mostrato grandi miglioramenti nella riproducibilità dei dati nel rapporto segnale/rumore e una migliore quantificazione rispetto alla DDA. In questo lavoro, il nostro obiettivo è quello di implementare la DIA secondo il metodo riportato da Tose et al.2. Abbiamo migliorato la riproducibilità e l’intensità dei segnali, fornendo ulteriori e più conclusive informazioni sulla mobilizzazione, distribuzione e metabolismo dei lipidi SIL in campioni biologici sfruttando l’acquisizione di DDA e DIA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel valutare l’uso di questo protocollo, è essenziale assicurarsi che i parametri DIA-PASEF e MS/MS siano applicabili ai trigliceridi in questione. In particolare, le finestre di mobilità e la larghezza delle finestre dovrebbero seguire lo schema dei trigliceridi. Questo può essere determinato con un’esecuzione precedente utilizzando il metodo DDA. Quando si tracciano i trigliceridi nello standard interno, le finestre per la configurazione della DIA dovrebbero coprire tutte le molecole di interesse pre-identificate. L…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori apprezzano i contributi del Dr. Cesar Ramirez durante gli sviluppi iniziali del metodo. Questa ricerca è stata finanziata dalle sovvenzioni NIAID R21AI167849 a FGN, progetto 22-21244S dalla Czech Science Foundation, Repubblica Ceca a MN.
Materials
| Accucore C30 colum | Thermo Fisher Scientific | 27826-252130 | |
| Bruker Compass Data Analysis | Bruker Daltonics Inc | 2363525870 | Version 5.2 |
| d-Glucose-13C6 | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | |
| EquiSplash Lipidomix | Avanti Polar Lipids | 330731-1EA | |
| glass vials | Thermo Fisher Scientific | 11-417-236 | |
| heavy water (2H2O) | Sigma-Aldrich | 1.13366 | |
| polypropylene pestles | Fisher Scientific | BAF199230001 | |
| Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph | Shimadzu | L20234651907 | |
| silanized glass inserts | Thermo Fisher Scientific | 03-251-826 | |
| Sucrose-13C12 | Sigma-Aldrich | 605417 | |
| timsTOF | Bruker Daltonics Inc | 1.84443E+11 | |
| Tuning Mix Calibration Standard | Agilent Technologies | 36 |
Referências
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