Traçage de novo des lipides à l’aide du marquage des isotopes stables LC-TIMS-TOF MS/MS
Summary
Voici une méthode de criblage des structures lipidiques par marquage d’isotopes stables en utilisant leur temps de rétention, leur mobilité et leur fragmentation.
Abstract
Les lipides sont très diversifiés, et de petits changements dans les structures et la composition des lipides peuvent avoir des effets profonds sur les fonctions biologiques critiques. Le marquage des isotopes stables (SIL) offre plusieurs avantages pour l’étude de la distribution, de la mobilisation et du métabolisme des lipides, ainsi que pour la synthèse de novo des lipides. La mise en œuvre réussie de la technique SIL nécessite l’élimination des interférences des molécules endogènes. Dans le présent travail, nous décrivons un protocole analytique à haut débit pour le criblage des lipides SIL à partir d’échantillons biologiques ; Des exemples d’identification lipidique de novo au cours du développement des ovaires des moustiques seront présentés. L’utilisation de la chromatographie en phase liquide complémentaire, de la spectrométrie de mobilité des ions piégés et de la spectrométrie de masse permet la séparation et l’attribution des lipides à partir d’un seul échantillon en un seul balayage (<1 h). L’approche décrite tire parti des développements récents en matière d’acquisition dépendante des données et d’acquisition indépendante des données, en utilisant l’accumulation parallèle dans le piège de mobilité suivie d’une fragmentation séquentielle et d’une dissociation induite par la collision. La mesure de la SIL au niveau de la chaîne d’acides gras révèle des changements dans la dynamique des lipides au cours du développement ovaire des moustiques. Les structures lipidiques de novo sont attribuées avec confiance en fonction de leur temps de rétention, de leur mobilité et de leur modèle de fragmentation.
Introduction
Lors de l’analyse des données lipidiques, le marquage des isotopes stables (SIL) est une méthode efficace pour évaluer les voies métaboliques dans les organismes vivants. Dans cette méthode, les atomes d’un analyte sont remplacés par des isotopes stables contenant 13C ou 2H. Ces isotopes sont ensuite incorporés dans des précurseurs, qui sont ensuite intégrés dans les acides gras, marquant les zones dans lesquelles ils résident. Avec ces isotopes, on est en mesure d’identifier la distribution et le métabolisme des lipides, car ils contrastent avec le fond non marqué1. Les plateformes courantes de spectrométrie de masse ne sont pas capables de distinguer le signal provenant des molécules endogènes2. Le succès de SIL passe par l’utilisation d’outils analytiques à ultra-haute résolution. La chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de mobilité des ions piégés à haute résolution-accumulation parallèle, fragmentation séquentielle-temps de vol, spectrométrie de masse en tandem (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) permet de séparer les espèces marquées et non marquées2. L’avantage de l’analyse LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS est que le signal MS peut être filtré par le temps de rétention (RT) et la mobilité, réduisant ainsi les interférences potentielles des molécules endogènes, ainsi que la quantification et la séparation de toutes les espèces souhaitées2. Dans TIMS, un ion est d’abord maintenu stationnaire contre une phase gazo-mobile, puis libéré en fonction de sa mobilité. Cela permet d’obtenir des mobilogrammes haute résolution tout en fonctionnant à une tension inférieure à celle de l’instrumentation IMS3 précédente. Les mobilogrammes sont des graphiques de la masse à charge en fonction du temps de dérive qui peuvent être utilisés pour distinguer les composés en fonction de leur temps de dérive et de la quantité de chevauchement4.
En utilisant une technique PASEF supplémentaire, la vitesse de séquençage est considérablement augmentée sans sacrifier la sensibilité5. La théorie PASEF implique l’accumulation d’ions suivie de leur libération séquentielle dans l’ordre de leur mobilité. Cela se fait en accumulant des ions dans un alignement parallèle à leur mobilité. L’accumulation de cette manière empêche la perte d’ions. De plus, la sélection des ions précurseurs se produit en même temps que l’accumulation et la libération des ions. Avec cette méthode, PASEF sélectionne plusieurs précurseurs en série lors de chaque balayage TIMS, plutôt que les précurseurs individuels par balayage typiques d’un instrument TIMS qui n’utilise pas PASEF. Lorsque les ions précurseurs sont accumulés et libérés simultanément en pics de 2 ms dans le cadre d’un balayage TIMS d’environ 100 ms par trame, le signal est amplifié de plus d’un ordre de grandeur, ce qui augmente le rapport signal/bruit3. L’ajout du PASEF au TIMS augmente l’efficacité du MS/MS. Comme le TIMS-PASEF est couplé à MS/MS, une fragmentation plus efficace est possible. Contrairement à la détection MS/MS conventionnelle, le signal du précurseur est compressé à partir du TIMS-PASEF, et les ions fragmentaires sont détectés simultanément au temps d’élution TIMS et à la position de mobilité ionique du précurseur3.
Lors de l’acquisition de données à partir d’un spectromètre de masse, il existe des options dans le mode de balayage souhaité. L’acquisition dépendante des données (DDA) sélectionne les ions précurseurs du balayage MS1 en fonction de leur abondance, avant de les fragmenter et d’effectuer le balayage MS2. Ce mode d’analyse fragmente autant de précurseurs que possible. L’approche DDA est ciblée et les résultats dépendront de la sélection de l’ion3. Cependant, le DDA-PASEF présente souvent des problèmes de reproductibilité entre les répétitions. Bien que la DDA soit un excellent outil dans une analyse ciblée, les mélanges complexes ont plus de difficultés dans l’acquisition de leurs données6. En effet, seule une petite quantité d’ions peut être surveillée simultanément3. L’acquisition indépendante des données (DIA) est une méthode dans laquelle les fenêtres présélectionnées de m/z sont fragmentées indépendamment de leur intensité, et toutes sont balayées dans la plage7. Avec ce mode de balayage, des nuages d’ions entiers sont transmis de l’IMS au spectromètrede masse 3. Dans les études protéomiques, cela se traduit par de plus grandes quantités de protéines quantifiées dans un laps de temps plus court par rapport à la DDA. De plus, DIA manque moins de valeurs m/z par rapport à DDA. Par conséquent, cette alternative a montré de grandes améliorations dans la reproductibilité des données dans le rapport signal sur bruit et une meilleure quantification que la DDA. Dans ce travail, notre objectif est d’appliquer la DIA à la méthode rapportée par Tose et al.2. Nous avons amélioré la reproductibilité et l’intensité des signaux, ce qui nous a permis d’obtenir des informations supplémentaires et plus concluantes sur la mobilisation, la distribution et le métabolisme des lipides SIL dans les échantillons biologiques, en tirant parti de l’acquisition de DDA et de DIA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lors de l’évaluation de l’utilisation de ce protocole, il est essentiel de s’assurer que les paramètres DIA-PASEF et MS/MS sont applicables aux triglycérides en question. Plus précisément, les fenêtres de mobilité et la largeur de la fenêtre doivent suivre le modèle des triglycérides. Cela peut être déterminé à l’aide d’une exécution précédente à l’aide de la méthode DDA. Lors du suivi des triglycérides dans l’étalon interne, les fenêtres de mise en place de l’DIA doivent couvrir tou…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à souligner la contribution du Dr Cesar Ramirez au cours du développement initial de la méthode. Cette recherche a été financée par les subventions du NIAID R21AI167849 au FGN, le projet 22-21244S de la Fondation tchèque pour la science, République tchèque au MN.
Materials
| Accucore C30 colum | Thermo Fisher Scientific | 27826-252130 | |
| Bruker Compass Data Analysis | Bruker Daltonics Inc | 2363525870 | Version 5.2 |
| d-Glucose-13C6 | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | |
| EquiSplash Lipidomix | Avanti Polar Lipids | 330731-1EA | |
| glass vials | Thermo Fisher Scientific | 11-417-236 | |
| heavy water (2H2O) | Sigma-Aldrich | 1.13366 | |
| polypropylene pestles | Fisher Scientific | BAF199230001 | |
| Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph | Shimadzu | L20234651907 | |
| silanized glass inserts | Thermo Fisher Scientific | 03-251-826 | |
| Sucrose-13C12 | Sigma-Aldrich | 605417 | |
| timsTOF | Bruker Daltonics Inc | 1.84443E+11 | |
| Tuning Mix Calibration Standard | Agilent Technologies | 36 |
Referências
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