Отслеживание липидов de novo с помощью мечения стабильными изотопами LC-TIMS-TOF MS/MS
Summary
Здесь представлен метод скрининга липидных структур с помощью мечения стабильными изотопами с использованием времени их удержания, подвижности и фрагментации.
Abstract
Липиды очень разнообразны, и небольшие изменения в структуре и составе липидов могут оказывать глубокое влияние на важнейшие биологические функции. Мечение стабильными изотопами (SIL) дает ряд преимуществ для изучения распределения, мобилизации и метаболизма липидов, а также синтеза липидов de novo . Для успешной реализации методики SIL необходимо устранить интерференции от эндогенных молекул. В настоящей работе мы описываем высокопроизводительный аналитический протокол для скрининга липидов SIL из биологических образцов; Будут показаны примеры идентификации липидов de novo во время развития яичников комаров. Использование комплементарной жидкостной хроматографии, спектрометрии подвижности захваченных ионов и масс-спектрометрии позволяет отделить и распределить липиды из одного образца за одно сканирование (<1 ч). Описанный подход использует преимущества последних разработок в области сбора, зависящего от данных, и сбора, независимого от данных, с использованием параллельного накопления в ловушке мобильности с последующей последовательной фрагментацией и диссоциацией, вызванной столкновением. Измерение SIL на уровне цепи жирных кислот выявляет изменения в динамике липидов во время развития яичников комаров. Структуры липидов de novo надежно присваиваются на основе времени их удержания, подвижности и характера фрагментации.
Introduction
При анализе липидных данных мечение стабильными изотопами (SIL) является эффективным методом оценки метаболических путей в живых организмах. В этом методе атомы внутри анализируемого вещества заменяются стабильными изотопами, содержащими 13C или 2H. Эти изотопы в дальнейшем включаются в предшественники, которые позже встраиваются в жирные кислоты, обозначая области, в которых они находятся. С помощью этих изотопов можно идентифицировать распределение и метаболизм липидов, так как они будут контрастировать на немаркированном фоне1. Обычные масс-спектрометрические платформы не способны различать сигнал, поступающий от эндогенных молекул2. Успех SIL требует использования аналитических инструментов со сверхвысоким разрешением. Жидкостная хроматография в сочетании со спектрометрией подвижности захваченных ионов с высоким разрешением, параллельным накоплением, последовательной фрагментацией-времяпролетной тандемной масс-спектрометрией (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) позволяет разделять меченые и немеченые виды2. Преимущество анализа LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS заключается в том, что сигнал МС может быть отфильтрован по времени удержания (RT) и подвижности, что снижает потенциальную интерференцию эндогенных молекул, а также количественное определение и разделение всех желаемых веществ. В TIMS ион сначала удерживается неподвижно против газомобильной фазы, а затем высвобождается в соответствии с его подвижностью. Это обеспечивает получение мобилограмм с высоким разрешением при работе при более низком напряжении по сравнению с более ранними приборами IMS3. Мобилограммы представляют собой графики зависимости массы заряда от времени дрейфа, которые можно использовать для различения соединений на основе времени их дрейфа и величины перекрытия4.
Использование дополнительной техники PASEF значительно увеличивает скорость секвенирования без ущерба для чувствительности5. Теория PASEF предполагает накопление ионов с последующим их последовательным высвобождением в порядке их подвижности. Это делается путем накопления ионов в параллельном выравнивании по их подвижности. Накопление таким образом предотвращает потерю ионов. Кроме того, выбор ионов-предшественников происходит одновременно с накоплением и высвобождением ионов. С помощью этого метода PASEF выбирает несколько прекурсоров последовательно во время каждого сканирования TIMS, а не отдельные предшественники за сканирование, типичное для прибора TIMS, в котором не используется PASEF. Когда ионы-предшественники одновременно накапливаются и высвобождаются с пиками в 2 мс в течение сканирования TIMS с частотой примерно 100 мс на кадр, сигнал усиливается более чем на один порядок, тем самым увеличивая отношение сигнал/шум3. Дополнение PASEF к TIMS повышает эффективность MS/MS. Поскольку TIMS-PASEF связан с MS/MS, возможна более эффективная фрагментация. В отличие от обычного детектирования МС/МС, сигнал прекурсора сжимается из TIMS-PASEF, и ионы фрагментов детектируются одновременно с временем элюирования TIMS и положением подвижности ионов предшественника3.
При получении данных с масс-спектрометра существуют опции в желаемом режиме сканирования. Данные, зависимые от сбора данных (DDA) выбирают ионы-предшественники из сканирования MS1 на основе их распространенности, прежде чем фрагментировать их и выполнить сканирование MS2. Этот режим сканирования фрагментирует как можно больше предшественников. Подход DDA является целенаправленным, и результаты будут зависеть от выбора ионов3. Тем не менее, DDA-PASEF часто имеет проблемы с воспроизводимостью между репликациями. В то время как DDA является отличным инструментом для целенаправленного анализа, сложные смеси имеют большие трудности при сборе данных6. Это связано с тем, что одновременно можно контролировать только небольшое количество ионов3. Независимый сбор данных (DIA) — это метод, при котором предварительно выбранные окна m/z фрагментируются независимо от их интенсивности, и все они сканируются в диапазоне7. В этом режиме сканирования целые ионные облака передаются из IMS на масс-спектрометр3. В исследованиях протеомики это приводит к количественному определению большего количества белков за более короткий промежуток времени по сравнению с DDA. Кроме того, DIA пропускает меньше значений m/z по сравнению с DDA. Таким образом, эта альтернатива продемонстрировала значительное улучшение воспроизводимости данных в соотношении сигнал/шум и лучшую количественную оценку по сравнению с DDA. В данной работе наша цель состоит в том, чтобы реализовать DIA в методе, описанном Tose et al.2. Мы улучшили воспроизводимость и интенсивность сигналов, получив дополнительную и более убедительную информацию о мобилизации, распределении и метаболизме липидов SIL в биологических образцах, используя преимущества сбора DDA и DIA.
Protocol
Representative Results
Discussion
При оценке использования этого протокола важно убедиться, что параметры DIA-PASEF и MS/MS применимы к рассматриваемым триглицеридам. В частности, окна мобильности и ширина окон должны соответствовать схеме триглицеридов. Это можно определить с помощью предыдущего прогона с помощью метода DDA…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность доктору Сезару Рамиресу за его вклад в разработку метода. Это исследование финансировалось грантами NIAID R21AI167849 FGN, проект 22-21244S от Чешского научного фонда, Чешская Республика до Миннесоты.
Materials
| Accucore C30 colum | Thermo Fisher Scientific | 27826-252130 | |
| Bruker Compass Data Analysis | Bruker Daltonics Inc | 2363525870 | Version 5.2 |
| d-Glucose-13C6 | Sigma-Aldrich | 389374 | |
| eppendorf tubes | Fisher Scientific | 14-282-300 | |
| EquiSplash Lipidomix | Avanti Polar Lipids | 330731-1EA | |
| glass vials | Thermo Fisher Scientific | 11-417-236 | |
| heavy water (2H2O) | Sigma-Aldrich | 1.13366 | |
| polypropylene pestles | Fisher Scientific | BAF199230001 | |
| Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph | Shimadzu | L20234651907 | |
| silanized glass inserts | Thermo Fisher Scientific | 03-251-826 | |
| Sucrose-13C12 | Sigma-Aldrich | 605417 | |
| timsTOF | Bruker Daltonics Inc | 1.84443E+11 | |
| Tuning Mix Calibration Standard | Agilent Technologies | 36 |
Referências
- Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).
- Tose, L. V., et al. Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies. Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).
- Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100138 (2021).
- Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics. Metabolomics. 12 (3), 50 (2016).
- Meier, F., et al. Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
- Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA. Proteomics. 18 (1), 1700304 (2018).
- Fernández-Costa, C., et al. Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results. J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).
- Prakash, A., et al. Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis. J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).
- Tsou, C. C., et al. DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).
- Triebl, A., Wenk, M. R. Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics. Biomolecules. 8 (4), 151 (2018).
