Consideraciones prácticas para el diseño, la ejecución y la interpretación de estudios que involucran ensayos de flexión de huesos enteros de huesos de roedores
Summary
Las pruebas mecánicas de huesos de roedores son un método valioso para extraer información sobre la susceptibilidad de un hueso a las fracturas. Al carecer de una comprensión práctica adecuada, los resultados pueden sobreinterpretarse o carecer de validez. Este protocolo servirá como guía para garantizar que las pruebas mecánicas se realicen con precisión para proporcionar datos válidos y funcionales.
Abstract
La fragilidad esquelética que conduce a la fractura es una crisis de salud pública estadounidense que resulta en 1.5 millones de fracturas cada año y $18 mil millones en costos de atención directa. La capacidad de comprender los mecanismos subyacentes a la enfermedad ósea y la respuesta al tratamiento no solo es deseable, sino fundamental. Las pruebas mecánicas del hueso sirven como una técnica valiosa para comprender y cuantificar la susceptibilidad de un hueso a la fractura. Si bien este método parece simple de realizar, se puede llegar a conclusiones inapropiadas e inexactas si el usuario no tiene en cuenta los supuestos rectores y los pasos clave. Esto se ha observado en todas las disciplinas, ya que se siguen publicando estudios con un mal uso de los métodos y una interpretación incorrecta de los resultados. Este protocolo servirá como una introducción a los principios asociados con las pruebas mecánicas junto con la aplicación de estas técnicas, desde las consideraciones del tamaño de la muestra, pasando por la recolección y el almacenamiento de tejidos, hasta el análisis y la interpretación de los datos. Con esto en la mano, se puede obtener información valiosa sobre la susceptibilidad de un hueso a la fractura, lo que aumenta la comprensión tanto para la investigación académica como para las soluciones clínicas.
Introduction
Las pruebas mecánicas del hueso son el método principal para extraer información funcional relacionada con la susceptibilidad de un hueso a las fracturas. En los estudios preclínicos, se pueden utilizar varias modalidades de prueba, pero la más común es, con mucho, la flexión de los huesos largos. Estas pruebas son fáciles de realizar y se pueden usar en huesos que varían en tamaño desde humanos hasta ratones. Dado que los ratones son uno de los animales más estudiados en la investigación preclínica, este protocolo se centrará en las pruebas de flexión realizadas en el fémur y las tibias de los ratones.
Antes de realizar las pruebas de flexión, los huesos deben cosecharse y almacenarse adecuadamente. Los métodos de almacenamiento más comunes han sido tradicionalmente la congelación de huesos en gasas empapadas en solución salina, la congelación en solución salina sola o la deshidratación de huesos en etanol 1. Se ha demostrado que los huesos almacenados en etanol tienen una mayor rigidez y módulo elástico y una disminución de los parámetros de deformación en comparación con los almacenados congelados1. Incluso la rehidratación de los huesos antes de la prueba no recupera estas propiedades a niveles normales 1. Almacenar sumergido en solución salina podría causar daño al hueso, ya que se ejerce presión a medida que la solución salina se expande. Además, se requeriría una descongelación completa de la solución para extraer los huesos para la exploración por microtomografía computarizada (μCT). En consecuencia, congelar los huesos recién cosechados en una gasa empapada en solución salina se ha convertido en el método de almacenamiento estándar y se recomienda a lo largo de este protocolo.
Debido a que el tamaño y la forma de un hueso afectan su fuerza de volumen y muchos modelos de enfermedades alteran significativamente el tamaño y la morfología del hueso, los principios de ingeniería se utilizan para normalizar los efectos del tamaño para producir propiedades que estimen el comportamientodel tejido. Este enfoque requiere una geometría de sección transversal de la ubicación de la falla, que se adquiere más comúnmente utilizando μCT para crear escaneos de los huesos antes de la prueba. μCT es ampliamente utilizado debido a su disponibilidad y alta resolución de imagen. Además, no se incluyen las contribuciones de tejidos blandos y la exploración no requiere fijación química u otras modificaciones en el hueso 3,4. En todas las formas de TC, una fuente de rayos X se enfoca en un objeto, mientras que un detector en el otro lado del objeto mide la energía de rayos X resultante. Esto produce una sombra de rayos X de la muestra que se puede convertir en una imagen 3,5. El objeto que se está escaneando se gira (o la fuente de rayos X y el detector se giran alrededor de la muestra), generando imágenes que se pueden reconstruir en un conjunto de datos tridimensionales que representa el objeto5.
La resolución de escaneo, es decir, la proximidad entre sí que pueden estar dos objetos y resolverse individualmente, se controla cambiando el tamaño nominal del vóxel o el tamaño de un píxel en la imagen resultante. En general, se acepta que los objetos deben tener al menos dos veces el tamaño de un solo vóxel para ser identificados3, pero una relación más alta permitirá una mayor precisión. Además, los vóxeles más grandes son más propensos a efectos de volumen parcial: cuando un solo vóxel contiene tejidos de diferentes densidades, se le asigna el promedio de estas densidades, en lugar de la densidad específica de un solo tejido, lo que puede conducir a una sobreestimación o subestimación de las áreas de tejido y la densidad mineral3. Si bien estos problemas se pueden mitigar eligiendo tamaños de vóxel más pequeños, el uso de una resolución más alta no garantiza la eliminación de los efectos de volumen parcial y puede requerir tiempos de escaneo más largos3. Cuando se escanean huesos ex vivo, generalmente se recomienda un tamaño de vóxel de 6-10 μm para evaluar con precisión la arquitectura trabecular de los huesos de ratón. Se puede usar un tamaño de vóxel más grande de 10-17 μm para el hueso cortical, aunque se debe usar el tamaño de vóxel razonable más pequeño. Este protocolo utiliza un tamaño de vóxel de 10 μm, que es lo suficientemente pequeño como para diferenciar las propiedades trabeculares clave y minimizar los efectos de volumen parcial sin un tiempo de escaneo extenso.
La energía de rayos X y los ajustes del filtro de energía también deben seleccionarse cuidadosamente, ya que la alta densidad mineral y el grosor del tejido óseo atenúan y alteran en gran medida el espectro de energía de rayos X transmitido. En general, se asume que debido a que el espectro de rayos X emitido es equivalente al espectro que sale del objeto6, el uso de rayos X de baja energía en objetos densos como el hueso puede conducir a un artefacto conocido como endurecimiento del haz7. Se recomienda un voltaje más alto de 50-70 kVp cuando se escanean muestras óseas para reducir la incidencia de estos artefactos5. Además, la inserción de un filtro de energía de aluminio o cobre crea un haz de energía más concentrado, lo que minimiza aún más los artefactos 4,7. Se utilizará un filtro de aluminio de 0,5 mm a lo largo de este protocolo.
Por último, el paso de rotación del escaneo y la longitud de rotación (por ejemplo, 180°-360°), controlan juntos el número de imágenes capturadas, lo que determina la cantidad de ruido en el escaneo final4. Promediar varios fotogramas en cada paso puede reducir el ruido, pero puede aumentar el tiempo de exploración4. Este protocolo utiliza un paso de rotación de 0,7 grados y un promedio de fotogramas de 2.
Una nota final sobre el escaneo: los maniquíes de calibración de hidroxiapatita deben escanearse utilizando la misma configuración de escaneo que los huesos experimentales para permitir la conversión de los coeficientes de atenuación a densidad mineral en g/cm35. Este protocolo utiliza maniquíes de 0,25 g/cm3 y 0,75 g/cm3 de hidroxiapatita, aunque existen diferentes maniquíes disponibles. Tenga en cuenta que algunos sistemas de escaneo utilizan maniquíes internos como parte de la calibración diaria del sistema.
Una vez que se completa el escaneo, las proyecciones angulares se reconstruyen en imágenes transversales del objeto, generalmente utilizando el software adjunto del fabricante. Cualquiera que sea el sistema que se utilice, es importante asegurarse de que todo el hueso se capture en la reconstrucción y que el umbral se establezca adecuadamente para permitir el reconocimiento del hueso frente al no hueso. Después de la reconstrucción, es fundamental rotar todas las exploraciones en tres dimensiones para que los huesos estén orientados de manera consistente y correctamente alineados con el eje transversal, nuevamente utilizando el software del fabricante.
Después de la rotación, se pueden seleccionar regiones de interés (ROI) para el análisis en función de si se desean propiedades corticales, propiedades trabeculares o geometría de fractura para la normalización mecánica. Para este último, los ROI deben seleccionarse después de la prueba midiendo la distancia desde el sitio de la fractura hasta un extremo del hueso y utilizando el tamaño del vóxel para determinar la ubicación de corte correspondiente en el archivo de escaneo. La región seleccionada debe tener al menos 100 μm de longitud, con el punto de fractura en el centro aproximado de la ROI, para proporcionar una estimación adecuada4.
Con los ROI seleccionados, se necesitan dos propiedades para la normalización mecánica (para calcular la tensión de flexión y la deformación): la distancia máxima desde el eje de flexión del neutro hasta la superficie donde se inicia la falla (se supone que es la superficie cargada en tensión, determinada por la configuración de la prueba) y el momento de inercia del área alrededor del eje neutro (también depende de la configuración de la prueba). Este protocolo recomienda el uso de un código personalizado para determinar estos valores. Para acceder al código, póngase en contacto directamente con el autor correspondiente o visite el sitio web del laboratorio en https://bbml.et.iupui.edu/ para obtener más información.
Una vez que se ha completado el escaneo μCT, pueden comenzar las pruebas mecánicas. Las pruebas de flexión se pueden realizar en configuraciones de cuatro o tres puntos. Se prefieren las pruebas de flexión de cuatro puntos, ya que eliminan la tensión de cizallamiento en el hueso entre los puntos de carga, lo que permite que se produzca una flexión pura en esta región3. El hueso se fracturará debido a la tensión, creando una falla que es más representativa de las verdaderas propiedades de flexión del hueso3. Sin embargo, el hueso debe cargarse de tal manera que entregue la misma carga en ambos puntos de carga (esto se puede facilitar con un cabezal de carga pivotante). En las pruebas de flexión de tres puntos, hay un gran cambio en la tensión de cizallamiento donde el punto de carga se encuentra con el hueso, lo que hace que el hueso se rompa en este punto debido al cizallamiento, no a la tensión3. Las normas ASTM recomiendan que los materiales que se someten a flexión deben tener una relación longitud-anchura de 16:1, lo que significa que la longitud del tramo de soporte debe ser 16 veces mayor que la anchura del hueso para minimizar los impactos del cizallamiento 8,9. Esto a menudo es imposible de lograr cuando se prueban huesos pequeños de roedores, por lo que el tramo de carga simplemente se hace lo más grande posible, pero con un cambio lo más pequeño posible en la forma de la sección transversal. Además, al realizar la flexión de cuatro puntos, la relación entre las longitudes del tramo inferior y superior debe ser de ~ 3: 18, lo que generalmente se puede lograr en la tibia, pero es difícil en el fémur más corto. Además, las paredes corticales más delgadas de los fémures los hacen susceptibles a la deformación de tipo anillo que cambia la forma de la sección transversal del hueso durante la prueba (esto se puede acentuar en las pruebas de cuatro puntos, ya que se requiere una mayor fuerza para inducir el mismo momento de flexión en comparación con la flexión de tres puntos). Por lo tanto, la flexión de tres puntos se utilizará para el fémur de ratón, mientras que la flexión de cuatro puntos se utilizará para las tibias a lo largo de este protocolo.
Por último, es importante potenciar adecuadamente el estudio para el análisis estadístico. Una recomendación general para los ensayos mecánicos es tener un tamaño de muestra de 10-12 huesos por grupo experimental para poder detectar diferencias, ya que algunas propiedades mecánicas, especialmente los parámetros postrendimiento, pueden ser muy variables. En algunos casos, esto puede significar comenzar con un tamaño de muestra animal más alto debido al desgaste que podría ocurrir durante el estudio. El análisis del tamaño de la muestra utilizando los datos existentes debe completarse antes de intentar un estudio.
Existen numerosas limitaciones y suposiciones, pero las pruebas de flexión pueden proporcionar resultados bastante precisos, especialmente cuando las diferencias relativas entre los grupos son de interés. Estas propiedades, junto con el análisis de la arquitectura trabecular y la morfología cortical, pueden proporcionar una mejor comprensión de los estados de la enfermedad y los regímenes de tratamiento. Si se tiene cuidado con los aspectos del experimento que están bajo nuestro control (por ejemplo, la recolección, el almacenamiento, el escaneo y las pruebas), podemos estar seguros de que se han generado resultados precisos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A lo largo del proceso de escaneo y prueba, hay momentos en los que la solución de problemas y la optimización son adecuadas. El primero de ellos ocurre cuando se escanean los huesos con μCT. Si bien muchos sistemas vienen con un soporte en el que se puede sostener y escanear un objeto, se pueden fabricar soportes personalizados para escanear varios huesos al mismo tiempo. El escaneo de varios huesos puede ser un punto excelente para la optimización, pero se debe tener precaución durante todo el proceso de escaneo y…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo realizado para desarrollar este protocolo ha sido apoyado por los Institutos Nacionales de Salud [AR072609].
Materials
| CTAn | Bruker | NA | CT Scan Analysis Software |
| DataViewer | Bruker | NA | CT Scan Rotation Software |
| Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a | MathWorks | NA | Coding platform used for data analysis |
| NRecon | Bruker | NA | CT Scan Reconstruction software |
| SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software | Micro Photonics Inc | SKY-016814 | Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object |
Referências
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