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Neurociência

EEG 기록 중 쥐의 측면 꼬리 정맥에서 뇌척수액 및 혈액 샘플링

Published: September 01, 2023
doi:
10.3791/65636
, , , , , ,
1Department of Neuroscience and Rehabilitation, Section of Pharmacology,Universita degli Studi di Ferrara

Summary

이 프로토콜은 지속적인 비디오 뇌전도(EEG) 모니터링과 병행하여 수행된 간질 쥐의 반복적인 뇌척수액 및 혈액 수집을 보여줍니다. 이는 다양한 체액 분자의 변화와 발작 활동 사이의 가능한 연관성을 탐구하는 데 도움이 됩니다.

Abstract

체액의 조성은 많은 생리학적 및 병리학적 역학을 반영하기 때문에 생물학적 액체 샘플은 일반적으로 호르몬, 성장 인자, 단백질 또는 작은 비암호화 RNA와 같은 관심 분자를 측정하기 위해 많은 실험 맥락에서 얻어집니다. 구체적인 예는 간질에 대한 바이오마커 연구에서 생물학적 액체의 샘플링입니다. 이러한 연구에서는 뇌척수액(CSF)과 혈장 내 분자 수준을 비교하고, 뇌척수액과 혈장을 병렬로 채취하고, 발작 시 샘플링까지의 시간 거리를 고려하는 것이 바람직합니다. 뇌척수액과 혈장 샘플링을 결합한 이 연구는 뇌전증 동물의 비디오-EEG 모니터링과 결합되어 추정 진단 및 예후 바이오마커의 검증을 위한 유망한 접근법입니다. 여기에서, 지속적으로 비디오 EEG를 모니터링하는 간질 쥐의 수조 마그나에서 뇌척수액을 채취하고 측면 꼬리 정맥에서 혈액을 샘플링하는 과정을 결합하는 절차를 설명합니다. 이 절차는 일반적으로 사용되는 다른 기술에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 통증이나 침습을 최소화하고 마취 시간을 단축하면서 신속한 샘플링이 가능합니다. 또한 테더 및 원격 측정 EEG 기록 쥐 모두에서 CSF 및 혈장 샘플을 얻는 데 사용할 수 있으며 여러 날의 실험에 걸쳐 반복적으로 사용할 수 있습니다. 이소플루란 마취를 단축하여 샘플링으로 인한 스트레스를 최소화함으로써 생체 유체에서 조사된 분자의 실제 수준을 보다 정확하게 반영할 수 있을 것으로 기대됩니다. 적절한 분석 분석의 가용성에 따라 이 기술은 EEG 기록을 동시에 수행하면서 여러 개의 다른 분자 수준을 측정하는 데 사용할 수 있습니다.

Introduction

뇌척수액(CSF)과 혈액 채취는 전임상 및 임상 연구 모두에서 뇌전증의 바이오마커를 식별하고 검증하는 데 중요합니다 1,2. 오늘날 뇌전증의 진단과 뇌전증 바이오마커에 대한 대부분의 연구는 EEG 및 신경영상에 초점을 맞추고 있습니다 3,4,5. 그러나 이러한 접근 방식에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 일상적인 두피 측정 외에도 많은 경우 EEG는 깊이 전극6과 같은 침습적 기술을 필요로 한다. 뇌 영상 기법은 시간적, 공간적 해상도가 낮고 상대적으로 비용과 시간이 많이 든다 7,8. 이러한 이유로, 비침습적, 저비용, 생체유체 기반 바이오마커의 식별은 매우 매력적인 대안을 제공할 것입니다. 또한 이러한 생체 유체 바이오마커를 사용 가능한 진단 접근법과 결합하여 예측성을 높일 수 있습니다.

뇌전증 진단을 받은 환자는 일상적으로 EEG 9,10 및 혈액 샘플링 11,12,13,14 을 시행하며, 많은 경우 생명을 위협하는 원인(예: 급성 감염, 자가면역 뇌염)을 배제하기 위해 뇌척수액 중단을 시행한다15. 이 혈액 및 CSF 샘플은 간질에 대한 바이오마커를 식별하기 위한 임상 연구에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, Hogg와 동료들은 인간 간질에서 발작이 일어나기 전에 3개의 혈장 tRNA 단편이 증가한다는 것을 발견했다14. 마찬가지로, 인간 뇌척수액과 혈청의 인터루킨-1베타(IL-1β) 수치는 혈청 대비 뇌척수액의 IL-1β 수치의 비율로 표현되며, 외상성 뇌손상 후 외상 후 뇌전증 발병을 예측할 수 있다16. 이러한 연구는 뇌전증 바이오마커 연구를 위한 생체유체 샘플링의 중요성을 강조하지만, 혈액 내 항간질제(AED)의 공동 설립 인자, 병인 정보의 빈번한 부족, 부적절한 대조군, 적당한 수의 환자 수 등 임상시험에 내재된 여러 가지 한계에 직면해 있습니다17,18.

전임상 연구는 뇌전증에 대한 잠재적인 바이오마커로서 생체 유체의 분자를 조사할 수 있는 다른 기회를 제공합니다. 실제로, EEG 기록을 수행하는 동안 동물에서 혈장 및/또는 CSF를 추출할 수 있습니다. 또한, 샘플링은 실험의 여러 날에 걸쳐 반복적으로 수행될 수 있으며, 연구의 견고성을 향상시키기 위해 여러 연령, 성별 및 간질 모욕 일치 대조군을 사용할 수 있습니다. 여기에서, EEG 모니터링 쥐의 꼬리 정맥에서 혈장을 병렬로 인출하여 수조 마그나에서 CSF를 얻는 유연한 기술이 자세히 설명되어 있습니다. 제시된 기술은 대체 방법에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 나비 바늘 접근법을 사용하면 뇌파 전극 또는 이와 유사한 머리 임플란트의 기능을 손상시키지 않고 뇌척수액을 여러 번 채취할 수 있습니다. 이는 상대적으로 높은 감염 위험과 관련된 척수강내 카테터 제거 절차의 개선을 나타냅니다. 또한, 채혈에 사용되는 보고된 자유 낙하 접근 방식은 혈액이 튜브를 통과하지 않고 진공 압력이 가해지지 않기 때문에 용혈 위험이 크게 감소하기 때문에 꼬리 정맥 혈액 인출의 다른 접근 방식보다 우수합니다. 세균이 없는 엄격한 조건에서 수행하면 동물의 감염 위험이 특히 낮습니다. 또한 동물의 꼬리 끝에서 혈액 채취를 시작하여 샘플링을 여러 번 반복할 수 있습니다. 이러한 기술은 마스터하기 쉽고 중추 신경계 장애에 대한 많은 전임상 연구에 적용될 수 있습니다.

Protocol

모든 실험 절차는 실험 및 기타 과학적 목적으로 사용되는 동물의 보호에 관한 1986년 11월 24일 유럽 공동체 위원회 지침(86/609/EEC)에 설명된 지침에 따라 페라라 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회와 이탈리아 보건부(승인: DM 603/2022-PR)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜은 쥐 CSF의 작은 비코딩 리보핵산(sncRNA) 및 간질 동물의 EEG 제어 하에 얻은 혈장의 추가 정량적 중합효소연쇄반응(qPCR) 분석을 …

Representative Results

9명의 대조군과 18마리의 만성 간질 쥐에서 수행된 다양한 CSF 및 혈액 인출 절차의 결과는 모두 SE 후 1개월에 전극을 이식한 것으로 성공률 측면에서 보고됩니다. 이식 후, 모든 쥐는 1개월 동안 비디오 EEG를 모니터링했으며, 그 동안 실험의 마지막 2주 동안(즉, SE 후 52, 55, 58, 61 및 64일, dpSE) 3일마다 CSF와 혈액을 5회 인출했습니다. 서로 다른 동물에서 여러 번 인출한 데이터를 사용하여 쌍두종 임플?…

Discussion

본 연구는 쥐의 뇌척수액 및 채혈 기술을 쉽게 습득할 수 있는 방법을 보여주며, 이는 간질 모델뿐만 아니라 알츠하이머, 파킨슨 또는 다발성 경화증과 같은 다른 신경학적 상태 또는 질병의 연구에도 유용할 수 있습니다. 간질 연구에서 비디오 EEG와 결합된 샘플링 절차는 서로 다른 용해성 분자의 수준과 발작 활동 사이의 상관 관계를 추구할 때 이상적입니다. 이러한 특별한 이유로, i) 간질을 정…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 보조금 계약 964712(PRIME, M. Simonato)에 따라 유럽 연합의 Horizon 2020 Work Programme(H2020-FETOPEN-2018-2020)의 보조금으로 지원되었습니다.

Materials

Blood collection set BD Vacutainer Safety-Lok BD Italy SpA, Milan, Italy 367246 Material
Blood Collection tubes (Microtainer K2E) BD Italy SpA, Milan, Italy 365975 Material
Butterfly Winged Infusion Set 23G x 3/4'' 0.6 x 19 mm Nipro, Osaka, Japan  PSY-23-ET-ICU Material
Centrifuge refrigerated ALC PK 130R DJB Labcare Ltd, Buckinghamshire, England 112000033 Material
Cotton suture 3-0 Ethicon, Johnson & Johnson surgical technologies, Raritan, New Jersey, USA 7343H Material
Diazepam 5 mg/2ml, Solupam Dechra Veterinary Products, Torino, Italy 105183014 (AIC) Solution
Digital video 8-channel media recorder system of telemetry EEG set up Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA PNM-VIDEO-008 Equipment
Digital video surveillance system of tethered EEG set up EZVIZ Network, Hangzhou, Cina EZVIZ (V5.3.2) Equipment
Disinfectant based on stabilized peroxides and quaternary ammonium activity Laboratoire Garcin-Bactinyl, France LB 920111 Solution
Dummy guide cannula 8 mm Agn Tho's, Lindigö, Sweden CXD-8 Material
Electrode 3-channel two-twisted Invivo1, Plastic One, Roanoke, Virginia, USA MS333/3-B/SPC Material
Electrode holder for stereotxic surgery Agn Tho's, Lindigö, Sweden 1776-P1 Equipment
Eppendorf BioSpectrometer basic Eppendorf AG, Hamburg, Germany 6137 Equipment

Eppendorf PCR Tubes 0.2 mL		 Eppendorf Srl, Milan, Italy 30124332 Material
Eppendorf μCuvette G1.0 Eppendorf AG, Hamburg, Germany 6138 Equipment
Feeding needle flexible 17G for rat Agn Tho's, Lindigö Sweden 7206 Material
Grass Technology apparatus Grass Technologies, Natus Neurology Incorporated, Pleasanton, California, USA M665G08 Equipment (AS40 amplifier, head box, interconnecting cables, telefactor model RPSA S40)
Isoflurane 100%, IsoFlo Zoetis, Rome, Italy 103287025 (AIC) Solution
Ketamine (Imalgene) Merial, Toulouse, France 221300288 (AIC) Solution
Lithium chloride  Sigma-Aldrich, Milan, Italy L9650 Material
Microinjection cannula 31G 9 mm Agn Tho's, Lindigö Sweden CXMI-9 Material
MP150 modular data acquisition and analysis system  Biopac, Goleta, California, USA MP150WSW Equipment
Ophthalmic vet ointment, Hylo night Ursapharm, Milan, Italy 941791927 (AIC) Material
Pilocarpine hydrochloride Sigma-Aldrich, Milan, Italy P6503 Material
PTFE Tube with joint Agn Tho's, Lindigö, Sweden JT-10 Material
Saline 0.9% NaCl, pH adjusted to 7.0 Solution
Scopolamine hydrobromide trihydrate Sigma-Aldrich, Milan, Italy S2250 Material
Scopolamine methyl nitrate Sigma-Aldrich, Milan, Italy S1876 Material
Silver sulfadiazine 1% cream  Sofar, Trezzano Rosa, Milan, Italy 025561010 (AIC) Material
Simplex rapid dental methacrylic cement   Kemdent, Associated Dental Products Ltd, Swindon, United Kingdom ACR811 Material
Stereotaxic apparatus David Kopf Instruments, Los Angeles, CA, USA Model 963 Equipment
Sucrose solution 10% sucrose in distilled water Home-made Solution
Syringe 1 mL  Biosigma, Cona, Venezia, Italy 20,71,26,03,00,350 Material
Telemeters Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA CTA-F40 Material
Telemetry EEG traces analyzer Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA NeuroScore v3-0 Equipment
Telemetry system Data Sciences International (DSI), St Paul, MN, USA Hardware plus software Ponemah core 6.51 Equipment
Xylazine hydrochloride Sigma-Aldrich, Milan, Italy X1251 Material
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Referências

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Soukupová, M., Guarino, A., Asth, L., Marino, P., Barbieri, M., Simonato, M., Zucchini, S. Sampling Cerebrospinal Fluid and Blood from Lateral Tail Vein in Rats During EEG Recordings. J. Vis. Exp. (199), e65636, doi:10.3791/65636 (2023).
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