וירוסים מדומים ככלי מולקולרי לניטור תגובות חיסוניות הומורליות נגד SARS-CoV-2 באמצעות בדיקת נטרול
Summary
וירוסים מדומים (PVs) הם נגיפים פגומים בשכפול המשמשים לחקר אינטראקציות בין וירוס מארח בתנאים בטוחים יותר מאשר טיפול בנגיפים אותנטיים. מוצג כאן פרוטוקול מפורט המראה כיצד ניתן להשתמש ב- SARS-CoV-2 PVs כדי לבדוק את יכולת הנטרול של נסיוב החולים לאחר חיסון COVID-19.
Abstract
וירוסים מדומים (PVs) הם כלים מולקולריים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור אינטראקציות בין וירוס מארח ולבדוק את יכולת הנטרול של דגימות בסרום, בנוסף לשימוש הידוע יותר שלהם בריפוי גנטי להעברת גן מעניין. PVs פגומים בשכפול מכיוון שהגנום הנגיפי מחולק לפלסמידים שונים שאינם משולבים ב- PVs. מערכת בטוחה ורב-תכליתית זו מאפשרת שימוש ב-PVs במעבדות ברמת בטיחות ביולוגית 2. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה כללית לייצור PVs לנטי-ויראליים המבוססים על שלושה פלסמידים שהוזכרו כאן: (1) פלסמיד עמוד השדרה הנושא את גן המדווח הדרוש לניטור הזיהום; (2) פלסמיד האריזה הנושא את הגנים לכל החלבונים המבניים הדרושים לייצור PVs; (3) פלסמיד ביטוי הגליקופרוטאין של מעטפת פני השטח הקובע את הטרופיזם של הנגיף ומתווך את כניסת הנגיפים לתא המארח. בעבודה זו, SARS-CoV-2 Spike הוא הגליקופרוטאין במעטפת המשמש לייצור של SARS-CoV-2 פסאודו-וירוסים פסאודו-טייפ שאינם משוכפלים.
בקצרה, תאי אריזה (HEK293T) הודבקו יחד עם שלושת הפלסמידים השונים בשיטות סטנדרטיות. לאחר 48 שעות, הסופרנאטנט שהכיל את ה-PVs נקצר, סונן ואוחסן בטמפרטורה של -80°C. ההדבקה של SARS-CoV-2 PVs נבדקה על ידי לימוד הביטוי של הגן המדווח (luciferase) בקו תא המטרה 48 שעות לאחר ההדבקה. ככל שהערך עבור יחידות לומינסנציה יחסית (RLUs) גבוה יותר, כך שיעור הזיהום/התמרה גבוה יותר. יתר על כן, PVs זיהומיות נוספו לדגימות הסרום בדילול סדרתי כדי לחקור את תהליך הנטרול של כניסת פסאודו-וירוסים לתאי המטרה, שנמדד כירידה בעוצמת RLU: ערכים נמוכים יותר המתאימים לפעילות נטרול גבוהה.
Introduction
וירוסים מדומים (PVs) הם כלים מולקולריים המשמשים במיקרוביולוגיה לחקר אינטראקציות בין וירוס מארח לפתוגן-פתוגן 1,2,3,4. PVs מורכבים מחלק פנימי, הליבה הנגיפית, המגנה על הגנום הנגיפי, וחלק חיצוני, הגליקופרוטאינים המעטפתיים על פני השטח של הנגיף המגדירה את הטרופיזם5. פסאודו-וירוס אינו כשיר לשכפול בתא היעד מכיוון שהוא אינו מכיל את כל המידע הגנטי ליצירת חלקיקים נגיפיים חדשים. שילוב זה של תכונות מוזרות הופך PVs חלופה בטוחה וירוס wildtype. וירוסים מסוג Wildtype, לעומת זאת, הם פתוגניים מאוד ולא ניתן להשתמש בהם במעבדות BSL 2 לניתוח6.
ההדבקה של PVs יכולה להיות מנוטרת על ידי גן reporter, בדרך כלל קידוד חלבון פלואורסצנטי (GFP, RFP, YFP) או אנזים המייצר מוצרים כימילומינסנטיים (luciferase). זה נכלל באחד פלסמידים המשמשים לייצור PV משולב בגנום של pseudovirus7.
קיימים כיום מספר סוגים של ליבות PV, כולל חלקיקים שמקורם בלנטי-ויראלי המבוססים על גנום HIV-1. היתרון הגדול של PVs מבוססי HIV-1 על פני פלטפורמות אחרות הוא תהליך האינטגרציה הפנימי שלהם בגנום תא היעד8. למרות ש- HIV-1 הוא נגיף מדבק מאוד והוא הגורם הסיבתי לאיידס, וקטורים לנטי-ויראליים אלה בטוחים לשימוש בגלל צעדי האופטימיזציה הנרחבים לאורך השנים. תנאי בטיחות אופטימליים הושגו עם הכנסת 2 וקטורים לנטי-ויראליים מהדורהשני, בהם הגנים הנגיפיים התרוקנו מבלי להשפיע על יכולות ההתמרה9. הדור השלישי והרביעי תרמו לבטיחות מוגברת של טיפול בווקטורים לנטי-ויראליים עם פיצול נוסף של הגנום הנגיפי לפלסמידיםנפרדים 10,11. הדורות האחרונים של PVs משמשים בדרך כלל לייצור וקטורים לנטי-ויראליים לריפוי גנטי.
PVs יכולים לשמש לחקר אינטראקציות בין וירוסים ותאים מארחים, הן בשלב הייצור והן בשלב הזיהום. PVs משמשים במיוחד במבחני נטרול פסאודו-וירוסים (PVNA). PVNA מאומתים באופן נרחב כדי להעריך את פוטנציאל הנטרול של סרום או פלזמה על ידי מיקוד הגליקופרוטאין הנגיפי במעטפתPV 12,13. פעילות נטרול, המתבטאת בריכוז מעכב 50 (IC50), מוגדרת כדילול של סרום/פלזמה החוסם 50% מכניסת חלקיקי הנגיפים14. בפרוטוקול זה, תיארנו את הקמתו של PVNA לבדיקת פעילות הנוגדנים נגד תסמונת נשימה חריפה חמורה – Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) בסרה שנאספה לפני ואחרי קבלת מנת חיסון דחף.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות ששימוש בנגיף wildtype מדמה את הזיהום בפועל, PVs לנטי-ויראליים הם אפשרות בטוחה יותר לחקור את המנגנונים הקשורים לכניסה וזיהום ויראלי ללא דרישות הבטיחות המחמירות הדרושות לעבודה עם וירוסים פתוגניים 4,20,21. PVs מורכבים מליבה נגיפית פגומה בשכפול…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מכירים בתרומתם של מתנדבי עובדי מערכת הבריאות. פרויקט זה נתמך על ידי המחלקה למצוינות 2023/2027, MUR, איטליה. AR ו- DZ נתמכו על ידי PRIN2022 (מימון האיחוד האירופי; הדור הבאהאיחוד האירופי)
Materials
| 0.45 μm filter | SARSTEDT | 83 1826 | |
| 6-well plate | SARSTEDT | 83 3920 | |
| 96-well plate | SARSTEDT | 8,33,924 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Merck | 10403892 | |
| Black Opaque 96-well Microplate | Perkin Elmer | 60005270 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | SIGMA-ALDRICH | D6546 – 500ML | |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) | AUROGENE | AU-L0615-500 | |
| Foetal Bovine Serum | AUROGENE | AU-S1810-500 | |
| Graphpad Prism version 7 | graphpad dotmatics | NA | In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program' |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEK293T/ACE2 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector. |
| L-glutamine | AUROGENE | AU-X0550-100 | |
| Luminometer – Victor3 | Perkin Elmer | HH35000500 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'luminometer' |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' |
| p8.91 packaging plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| pCSFLW reporter plasmid | Di Genova et al., 2021 | A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.) | |
| Penicillin/streptomycin | AUROGENE | AU-L0022-100 | |
| Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) | SIGMA-ALDRICH | 408727 | |
| RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) | Addgene | 145839 | This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2 |
| SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid | Addgene | pGBW-m4137382 | |
| steadylite plus Reporter Gene Assay System | Perkin Elmer | 6066759 | In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent' |
| Trypsin EDTA 1x | AUROGENE | AU-L0949-100 |
Referências
- Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963 (2012).
- Pouget, M., et al. Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945 (2021).
- McKay, L. G. A., et al. The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-κB signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway. Frontiers in Immunology. 13, 831695 (2022).
- Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies. Microbiological Research. 258, 126993 (2022).
- Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28, e1963 (2018).
- D’Apice, L., et al. Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay. Frontiers in Immunology. 13, 981693 (2022).
- Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives. Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).
- Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -. L., Verhoeyen, E. Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy. Viruses. 12, 1016 (2020).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
- Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).
- Berkhout, B. A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics. Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).
- Wu, X. Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71. Plos One. 8 (6), e64116 (2013).
- Ferrara, F., et al. Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies. Frontiers in Immunology. 12, 661379 (2021).
- Hu, J., et al. Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Genes & Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).
- Dalle Carbonare, L., et al. Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus naïve. Communications Medicine. 1 (1), 38 (2021).
- Di Genova, C., et al. Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes. Bio-protocol. 11 (21), e4236 (2021).
- Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bieńkowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays. NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).
- Chen, Q., et al. Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).
- Gauger, P. C., Vincent, A. L. Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).
- Miglietta, R., Pastori, C., Venuti, A., Ochsenbauer, C., Lopalco, L. Synergy in monoclonal antibody neutralization of HIV-1 pseudoviruses and infectious molecular clones. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 346 (2014).
- Chen, M., Zhang, X. -. E. Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review. International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).
- Zipeto, D., et al. Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes. Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).
- WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. Available from: https://covid19.who.int (2022)
- Zhou, P. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).
- Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states. Scientific Reports. 12 (1), 1554 (2022).
- Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies. Life. 12 (12), 2089 (2022).
- Watson, O. J., et al. Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).
- Cantoni, D. Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms. Vaccines. 11 (1), 58 (2023).
- Siracusano, G., et al. Different decay of antibody response and VOC sensitivity in naïve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22 (2022).
- Ruggiero, A. SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in naïve and previously COVID-19-infected individuals. eBioMedicine. 77, (2022).
- Piubelli, C. Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection. eBioMedicine. 89, 104471 (2023).
- Zhang, G. F. Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors. Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437 (2023).
- da Costa, K. A. S. Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design. Vaccines. 10 (9), 1520 (2022).
- Condor Capcha, J. M. Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651 (2021).
- Diomede, L., et al. Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity. Viruses. 13 (9), 1745 (2021).
