Pseudotypede vira som et molekylært værktøj til overvågning af humorale immunresponser mod SARS-CoV-2 via neutraliseringsanalyse

Summary

Pseudotypede vira (PV’er) er replikationsdefekte virioner, der bruges til at studere værtsvirusinteraktioner under sikrere forhold end håndtering af autentiske vira. Her præsenteres en detaljeret protokol, der viser, hvordan SARS-CoV-2 PV’er kan bruges til at teste den neutraliserende evne hos patienters serum efter COVID-19-vaccination.

Abstract

Pseudotypede vira (PV’er) er molekylære værktøjer, der kan bruges til at studere værtsvirusinteraktioner og til at teste serumprøvers neutraliserende evne ud over deres bedre kendte anvendelse i genterapi til levering af et gen af interesse. PV’er er replikationsdefekte, fordi det virale genom er opdelt i forskellige plasmider, der ikke er inkorporeret i PV’erne. Dette sikre og alsidige system tillader brug af solceller i laboratorier med biosikkerhedsniveau 2. Her præsenterer vi en generel metode til fremstilling af lentivirale PV’er baseret på tre plasmider som nævnt her: (1) rygradsplasmidet, der bærer reportergenet, der er nødvendigt for at overvåge infektionen; 2) emballageplasmidet, der bærer generne for alle de strukturelle proteiner, der er nødvendige for at generere solcellerne (3) kuvertoverfladen glycoproteinekspressionsplasmid, der bestemmer virustropisme og medierer viral indgang i værtscellen. I dette arbejde er SARS-CoV-2 Spike det kuvertglycoprotein, der anvendes til produktion af ikke-replikative SARS-CoV-2 pseudotypede lentivirus.

Kort fortalt blev emballeringsceller (HEK293T) co-transfekteret med de tre forskellige plasmider ved hjælp af standardmetoder. Efter 48 timer blev supernatanten indeholdende PV’erne høstet, filtreret og opbevaret ved -80 °C. Infektiviteten af SARS-CoV-2 PV’er blev testet ved at studere ekspressionen af reportergenet (luciferase) i en målcellelinje 48 timer efter infektion. Jo højere værdien for relative luminescensenheder (RLU’er), jo højere er infektions-/transduktionshastigheden. Desuden blev de infektiøse PV’er tilsat til de serielt fortyndede serumprøver for at studere neutraliseringsprocessen for pseudovirus’ indtræden i målceller, målt som reduktionen i RLU-intensitet: lavere værdier svarende til høj neutraliserende aktivitet.

Introduction

Pseudotypede vira (PV’er) er molekylære værktøjer, der anvendes i mikrobiologi til at studere værtsvirus og patogen-patogeninteraktioner 1,2,3,4. PV’er består af en indre del, den virale kerne, der beskytter det virale genom, og en ydre del, kuvertglycoproteinerne på overfladen af virussen, der definerer tropismen⁵. Et pseudovirus er replikationsinkompetent i målcellen, fordi det ikke indeholder al den genetiske information til at generere nye virale partikler. Denne kombination af ejendommelige funktioner gør PV’er til et sikkert alternativ til en vildtypevirus. Vildtypevirus er derimod højpatogene og kan ikke anvendes i BSL 2-laboratorier til analyse⁶.

Infektiviteten af PV’er kan overvåges af et reportergen, der normalt koder for et fluorescerende protein (GFP, RFP, YFP) eller et enzym, der producerer kemiluminescerende produkter (luciferase). Dette er indeholdt i et af plasmiderne, der anvendes til PV-produktion og inkorporeret i pseudovirusets genom⁷.

Der findes i øjeblikket flere typer PV-kerner, herunder lentivirale afledte partikler baseret på HIV-1-genomet. Den store fordel ved HIV-1-baserede solceller i forhold til andre platforme er deres iboende integrationsproces i målcellegenomet⁸. Selvom HIV-1 er en meget smitsom virus og er årsagsmidlet til aids, er disse lentivirale vektorer sikre at bruge på grund af de omfattende optimeringstrin gennem årene. Optimale sikkerhedsforhold blev opnået med introduktionen af 2. generations lentivirale vektorer, hvor virale gener blev udtømt uden at påvirke transduktionsevnen⁹. 3^. og 4^. generation bidrog til den øgede sikkerhed ved lentiviral vektorhåndtering med yderligere opdeling af det virale genom i separate plasmider^10,11. De nyeste generationer af PV’er anvendes generelt til at producere lentivirale vektorer til genterapi.

PV’er kan bruges til at studere interaktioner mellem vira og værtsceller under både produktions- og infektionsfaserne. PV’er anvendes især i pseudovirusneutraliseringsassays (PVNA). PVNA’er valideres bredt for at vurdere neutraliseringspotentialet for serum eller plasma ved at målrette det virale glycoprotein på PV’s kuvert^12,13. Neutraliseringsaktivitet, udtrykt som den hæmmende koncentration 50 (IC50), defineres som fortynding af serum/plasma, der blokerer 50% af viral partikelindgang¹⁴. I denne protokol beskrev vi opsætningen af et PVNA til test af antistofaktiviteten mod alvorligt akut respiratorisk syndrom – Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) i sera indsamlet før og efter modtagelse af en boostervaccinedosis.

Protocol

Denne protokol er godkendt af og følger retningslinjerne fra det etiske udvalg ved universitetet i Verona (godkendelsesprotokolnummer 1538). Der blev indhentet informeret skriftligt samtykke fra de mennesker, der deltog i undersøgelsen. Fuldblodsprøver blev indsamlet fra frivillige sundhedsarbejdere (HCW), der var i færd med at modtage anti-SARS-CoV-2-vacciner. Disse prøver blev opsamlet i plastrør indeholdende antikoagulantia til efterfølgende isolering af serum15. <p class="jove_conte…

Representative Results

Denne protokol beskriver produktionen af SARS-CoV-2 PV’er og en downstream-anvendelse af disse PV’er til at analysere neutraliseringsaktiviteten af serum / plasma hos forsøgspersoner, der modtager anti-COVID-19-vaccination17. Desuden kan denne protokol anvendes til at producere pseudotyper af hver SARS-CoV-2-variant af bekymring (VOC) for at teste udviklingen af det neutraliserende respons. På trods af at denne protokol letter undersøgelsen af humoralt immunrespons efter COVID-19-vaccination, k…

Discussion

Selvom brug af en vildtypevirus simulerer den faktiske infektion, er lentivirale PV’er en sikrere mulighed for at studere mekanismerne forbundet med viral indgang og infektion uden de strenge sikkerhedskrav, der er nødvendige for at arbejde med patogene vira ^4,20,21. PV’er består af en replikationsdefekt viral kerne omgivet af overfladehylsterglycoprotein af en patogen virus, hvilket er formålet med undersøgelsen.

<p cla…

Materials

0.45 μm filter	SARSTEDT	83 1826
6-well plate	SARSTEDT	83 3920
96-well plate	SARSTEDT	8,33,924
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units	Merck	10403892
Black Opaque 96-well Microplate	Perkin Elmer	60005270
Dulbecco's Modified Eagle Medium	SIGMA-ALDRICH	D6546 – 500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x)	AUROGENE	AU-L0615-500
Foetal Bovine Serum	AUROGENE	AU-S1810-500
Graphpad Prism version 7	graphpad dotmatics	NA	In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program'
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
HEK293T/ACE2 cells	ATCC	CRL-3216	HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.
L-glutamine	AUROGENE	AU-X0550-100
Luminometer – Victor3	Perkin Elmer	HH35000500	In the manuscript, we replace the commercial name with  'luminometer'
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium'
p8.91 packaging plasmid	Di Genova et al., 2021		A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
pCSFLW reporter plasmid	Di Genova et al., 2021		A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
Penicillin/streptomycin	AUROGENE	AU-L0022-100
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa)	SIGMA-ALDRICH	408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)	Addgene	145839	This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid	Addgene	pGBW-m4137382
steadylite plus Reporter Gene Assay System	Perkin Elmer	6066759	In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent'
Trypsin EDTA 1x	AUROGENE	AU-L0949-100